通过硝化由氨氧化细菌转化双酚A和烷基酚外文翻译资料

 2023-05-31 19:53:24

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附录 译文

通过硝化由氨氧化细菌转化双酚A和烷基酚

摘要：研究了氨氧化细菌（AOB）亚硝化

单胞菌ATCC 19718对双酚A（BPA）的转

化。在与四极杆飞行时间质谱（Q-TOF MS）

和核磁共振分析耦合的超级液相色谱（UPLC）

的基础上，我们发现N. europaea可以将

BPA转化为硝基和二硝基BPA，表明生

物亚硝酸盐和BPA之间的非生物硝化

在分批AOB系统中的BPA转化中起主要作用。亚硝酸

盐浓度，温度和pH值是影响反应速率的主要因素。此外，酵母雌激素筛选测定显示形成的硝基和二硝基BPA与其母体化合物BPA相比具有少得多的雌激素活性。对于4-n-octylphenol（nNP）和4-n-octylphenol（nOP），考虑非生物硝化的类似反应，因为通过UPLC-Q-TOF MS检测硝基-nNP和硝基-nOP，来自当地污水处理厂的结果（WWTP）显示硝基BPA和二硝基BPA在生物处理过程和影响，表明BPA的硝化也是去除BPA的途径。本研究的结果提示，污水处理厂中的AOB可能有助于通过非生物亚硝化去除所选择的内分泌干扰化合物（EDC）。

■引言

在水生环境中内分泌干扰化合物（EDCs）的存在引起了极大的关注，因为它与野生动物和鱼的性和生殖系统的不良反应的高发生率相关.1三种广泛检测的酚类EDC，双酚A BPA），4-正壬基苯酚（nNP）和4-正辛基苯酚（nOP）在本研究中进行研究。 BPA是单体，发现于环氧树脂中，通常用于罐衬和硬质聚碳酸酯塑料，如婴儿奶瓶，水壶和食品容器。此外，它广泛用于许多产品如粘合剂，建筑材料和粉末涂料。烷基酚，包括nNP和nOP，是烷基酚乙氧基化物的降解产物，其广泛用作家用和工业产品中的表面活性剂和洗涤剂。已知BPA和烷基酚都像激素一样干扰动物和人的内分泌系统。

污水处理厂排放的废水是EDC进入水生环境的主要来源.4,5报告的进水浓度范围为BPA为699〜1416 ng/L，nNP为43〜101 ng/L ，对于nOP为38至159ng/ L，而BPA的有效浓度为56至138ng/L，nNP为15至58ng/L，nOP为10至95ng /L。污水处理厂可以去除双酚有效地减少了90％以上，而他们去除了少于40％的烷基酚.6他们的大多数去除发生在生物处理过程中。

据报道，在污水处理厂中存在BPA-，NP-和OP-降解细菌。菌株MV1和Pseudomonas paucimobilis FJ-4，它们可以使用BPA作为唯一的碳和能量来源，分别从塑料制造设备的活性污泥7和环氧树脂制造厂8中分离。也报道了来自活性污泥的NP-和OP-降解细菌，包括Sphingobium xenophagum Bayram，9Sphingomonas cloacae S-3T，10和鞘氨醇单胞菌。 PWE1.11

氨的氧化是生物废水处理期间硝化过程的第一步。 该反应由氨氧化细菌（AOB），一组能够表达氨单加氧酶（AMO）酶的普遍存在的自养微生物进行。 除了氨氧化之外，已知AMO酶氧化宽范围的脂肪族和芳香族碳氢化合物.12-15先前的研究报道了硝化活性污泥能够有效降解天然和合成雌激素.16,17进一步研究使用纯AOB 确定了代谢物，并确认产生的亚硝酸盐和雌激素之间的非生物硝化和共代谢。

虽然先前的研究观察到通过硝化活性污泥的高BPA和NP降解，并且表明AOB和可能的AMO在它们的降解中起关键作用，20,21代谢物未被鉴定为支持它们的假设。 重要的是知道代谢物的命运和性质，因为它们可能产生额外的生态毒理学效应。 本研究的目的是确定AOB的BPA，nNP和nOP降解机理。 还检查了WWTP中降解副产物的发生。 这项研究的结果可以增强我们对BPA和烷基酚在废水处理过程和环境命运的理解。

■ 材料与方法

化学品和试剂。 BPA（99％），BPA-d16（98％）和nOP（99％）购自Sigma-Aldrich，nNP（98％）购自Alfa Aesar。 在浓度为1000mg/L的丙酮中制备BPA，nNP和nOP的储备溶液。 使用的所有其他试剂是可获得的最高级别的商业产品。

N.europaea的生长。 N. europaea ATCC 19718购自Nite Biological Resource Center。 在支持信息中描述的限定的矿物盐培养基中培养欧洲钩虫。 细胞浓度测量为通过UV-vis分光光度计在600nm处的吸光度（OD 600）。

N.europaea的BPA降解试验。进行实验以检查由欧洲古蜂球菌引起的BPA降解。首先，将已知量的BPA-丙酮储备溶液加入空的1L烧瓶中。在完全蒸发丙酮后，将生长培养基在黑暗中以150rpm振摇加入烧瓶中。 2天后，BPA完全溶解在烧瓶中的生长培养基中。然后将如前所述的制备的细胞悬浮液加入烧瓶中以开始实验。进行实验，初始OD 600约为0.025，（NH 4）2 SO 4浓度为25mM。将高压灭菌的细胞用作杀死对照。使用无BPA对照来评估N. europaea的原始氨氧化活性。在亚硝酸盐分析之前过滤样品（0.22mu;m）。将样品等分试样（4mL）用4mL乙醚萃取过液，并将2mL有机相转移到干净管中并蒸发至干燥。将干燥固体溶于0.5mL甲醇中。

在连续流生物反应器中的BPA通过N.europaea的生物转化。将连续流生物反应器（恒化器体积= 1.5L，流速接近300mL / d）保持28天，以研究欧洲鼻疽菌BPA的生物转移。 如上所述的培养基补充有BPA至终浓度为1mg / L。 培养基中，如上所描述，添加BPA终浓度为1 mg/L的细胞悬液的制备开始实验。 通过通气和搅拌（以150rpm）混合恒化器培养物。 定期取样直到4周。

BPA，nNP和nOP与亚硝酸盐的非生物反应。非生物批次试验在含有10mM磷酸盐缓冲液的超纯水水中进行，总体积为250mL。 pH范围为6.0至8.0，并且使用亚硝酸钠掺加NO 2至最终浓度为250mg N / L。 BPA，nNP和nOP的初始浓度为1mg / L。 测定在30℃下在黑暗中在振荡器（150rpm）上保持。 定期取样BPA，nNP和nOP的样品至120小时，并如上所述制备。 所有非生物测定一式两份进行。

酵母雌激素筛选（YES）测定。 合成具有高浓度的硝基-BPA和二硝基BPA的溶液用于分析雌激素性。 硝化步骤通过在pH 6.0的磷酸盐缓冲液中用过量NaNO 2（6250mg N / L）处理25mg / L BPA来进行。 在48小时合成后，通过使用乙醚的液 - 液萃取来纯化二硝基-BPA化学品。 通过在pH 6.0的磷酸盐缓冲液中用过量NaNO2（625mg N / L）处理2.5mg / L nNP或nOP来实现硝基-nNP或硝基-nOP的类似合成。 通过与四极飞行时间质谱（Q-TOF MS）偶联的超级液相色谱（UPLC）来确认同一性和纯度。

硝化代谢物的雌激素通过支持信息中描述的YES测定法测定。 测量OD620和OD540，以便计算如下式所示的校正值：校正值= OD540（样品） - [OD620（样品）-OD620（DMSO）]。

废水样品收集和制备。2011年8月和9月从中国厦门的一家当地家庭污水处理厂收集污水样品。该次级污水处理厂在最终效率之前配备有Orbal氧化沟工艺和UV消毒工艺。使用四升琥珀色玻璃瓶从污水处理厂处理过程的不同阶段收集废水样品，包括流入物，氧化沟的开始，氧化沟的终点和最终的净化。用硫酸将水样品酸化至pH2，并在取样后立即过滤。将300mL量的样品加入BPA-d16。使用固相萃取（SPE）浓缩样品，如在支持信息中详细描述的。来自SPE的洗脱液通过温和的氮气流蒸发至干。将残余物溶于0.5mL甲醇中，通过0.22mu;m膜过滤，将10mu;L注入高效液相色谱 - 三重四极杆质谱（HPLC-QqQ MS）系统中进行测定。

分析方法。 在分批和连续流动研究中，对于定量分析，使用具有UV检测器的Agilent 1200系列HPLC（Agilent Technologies，Germany）检测BPA，nNP和nOP及其硝化形式。 通过安捷伦C18柱（Zorbax Eclipse XDB-C18,4.6times;150mm，5mu;m）进行分离，流动相为水和甲醇，流速为1.0mL / min。 对于定性分析，通过Waters UPLC（Waters，USA）和Q-TOF MS（Bruker，Germany）鉴定BPA，nNP和nOP及其硝化形式。 使用Waters C18柱（Acquity UPLC BEH C18,2.1times;100mm，1.7mu;m），流速为0.2mL / min。 MS / MS在电喷雾离子化（ESI）负模式下操作，毛细管电压为2.5kV，碰撞能量为10eV。

为了获得核磁共振（NMR）信息，将BPA转化产物二硝基BPA蒸发至干，在CDCl 3中重构，并转移至NMR管。 1 H NMR，13 C NMR和异核多重相关光谱（HMBC）NMR数据用Avance III 600MHz NMR光谱仪（Bruker，USA）进行。

对于WWTP研究，通过HPLC-QqQ MS使用与ABI QqQ质谱仪（ABI，USA）连接的Shimadzu HPLC系统（Shimadzu，Japan）测定样品。 使用Dionex C18柱（Acclaim C18,3.0times;50mm，2.2mu;m），流速为0.5mL / min。 流动相为5mM乙酸铵水溶液（A）和甲醇（B）。 梯度最初为50％甲醇，保持1分钟，并在5分钟线性调节至90％，保持2分钟，并在7.1分钟时回到50％，保持2分钟。 MS使用多反应监测（MRM）模式在负ESI模式下操作。 监测的目标离子和参考离子显示在支持信息表S1中，其中还显示了解聚电位（DP），入口电位（EP），碰撞能量（CE）和碰撞池出口电位（CXP）。 BPA和二硝基BPA的方法检测限分别为0.008和0.0008mu;g/ L。 其他化学分析方法在支持信息中有详细描述。

■结果

在净化和连续条件下转化BPA。 在分批实验中观察到BPA的生物降解（1mg / L），如图1所示。在试验浓度下，BPA对鼻疽亚种不具有显着的毒性作用，因为细胞生长，亚硝酸盐产生和pH变化不受影响 在降解期间存在BPA（支持信息图S1）。

图1. N. Europaea对BPA的生物降解。 误差棒表示两个重复的范围。

由于在HPLC色谱图上观察到未知峰，形成了降解副产物（支持信息图S2）。为了了解由BPe降解的机制涉及的机制，UPLC-Q-TOF分析进行识别生成的产品。除了BPA之外，仅检测到两个另外的产物，m / z比为272和317.基于母离子的m / z，产物暂时鉴定为硝基和二硝基BPA（数据未显示） 。虽然已知N. europaea表达AMO来代谢广泛的底物，12-15预测的共代谢转化未检测到羟基化BPA的产物（m / z = 244）。连续流动研究的样品也通过UPLC-Q-TOF分析以研究BPA的转化产物。结果表明，在1至4周的每个样品中检测到硝基-BPA，仅在第二周样品中检测到二硝基BPA，并且没有检测到其他副产物（数据未显示）。这些结果表明，分批和连续的N.europaea培养物中的BPA降解是由于通过氨氧化产生的亚硝酸盐对BPA进行硝化。

非生物BPA硝化。此外，为了测试BPA转化不是N.europaea的结果的假说，将5天的N.europaea培养物中离心（在10 000g和4℃下30分钟）以除去细胞，并将BPA加入细胞中 的初始浓度为1mg/L的培养基。 随着硝基BPA和二硝基BPA的增加，BPA的降解趋势相似。 此外，用1mg/L BPA和250mg N/L亚硝酸盐进行非生物硝化测定。BPA可以在pH 6的非生物测定中除去，并且通过UPLC-Q-TOF（图2a）检测到两种产物，硝基-BPA和二硝基BPA，具有与N.europaea生物降解测定相同的保留时间和m/z比。

根据图2b-d所示产物的MS/MS碎裂途径，MS跃迁m/z 272→227支持将硝基BPA转化为BPA和m/z 317→272→227的建议转化 的二硝基BPA到硝基BPA和硝基BPA到BPA。 获得二硝基BPA的1H NMR谱，13C NMR谱和HMBC谱，以提供另外的结构信息（支持信息图S3）。HMBC光谱使用远程JC-H耦合相关的质子和碳2-4键离开。 如支持信息图S3c所示，质子（8.06ppm）显示与碳（42.02ppm）的3键偶联，其推断在每个苯环上的羟基的邻位的硝基取代。 在UPLC-Q-TOF和HMBC NMR分析的基础上，BPA的转化过程如图3所示。

非生物分批研究在30℃下进行，亚硝酸盐浓度为250mg N/L，pH 6.0,7.0和8.0。 pH6.0时的转化率高;然而，在pH 7.0或8.0下没有发生显着的BPA去除。进行另外的批次研究以比较在pH 6.0下在一定温度和亚硝酸盐浓度范围下BPA硝化的反应速率。一阶速率常数（k）由BPA浓度的自然对数随时间的线性回归计算。在30℃，对于10,100和250mg N/L亚硝酸盐，k值分别计算为0.002,0.012和0.014h -1，相关系数在0.861-0.992的范围内。在250mg N / L的亚硝酸盐浓度下，在10,20和30℃的温度下，k值分别为0.010,0.012和0.014h -1，相关系数在0.942-0.992的范围内。这些结果表明硝化速率是pH依赖性的，并且随着温度和亚硝酸盐浓度的增加而增加，这与先前的雌激素硝化相一致。

硝化BPA的雌激素。使用YES测定法来评价所产生的硝基-BPA和二硝基BPA的雌激素性。为了具有用于通过YES

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