用于蛋白质分离的改性氧化铝纳米纤维膜外文翻译资料

 2022-08-04 21:16:18

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用于蛋白质分离的改性氧化铝纳米纤维膜

摘要

生物物质的大规模提纯/分离是生物工程中快速生产生物物质所需的关键技术。膜过滤是一种新的分离工艺，在浓缩(去除溶剂)、脱盐(去除低分子量化合物)、澄清(去除颗粒)和分离(蛋白质-蛋白质分离)方面具有潜在的应用前景。在本研究中，我们开发了一种基于陶瓷纳米纤维的高效蛋白质分离膜。在多孔载体上制备了氧化铝纳米纤维，并形成了大流道。膜结构的根本性变化使得新型陶瓷膜的孔隙率大大提高(超过70%)，这是由于细纤维取代了大块颗粒作为建筑构件。孔径平均为11 nm，纯水通量约为360 L。用(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷自组装单分子膜对其进行表面改性，提高了膜的过滤性能。通过SEM、FTIR、接触角和蛋白质分离测试等表征表明，纤维层均匀地分布在多孔载体表面。接枝硅烷后，膜表面由亲水性转变为疏水性。结果表明，硅烷接枝氧化铝纤维膜对100% BSA蛋白和92%纤维素酶蛋白具有排斥作用。在维持48 L的渗透通量的同时，还能保留75%的胰蛋白酶蛋白。

1.引言

高效蛋白纯化在生物分离工程领域变得越来越重要，特别是在制药、食品和医疗应用领域。从生物混合物中分离蛋白质，如生物反应介质或组织提取物，在技术上具有挑战性，通常是大规模生物生产的一个关键限制因素。传统的分离技术包括劳动密集型的过程，如沉淀、过滤、离心、结晶、分辨聚焦亲和层析和电泳纯化。随着分离技术和先进材料的发展，膜过滤因其在节能、运行成本和环境影响等方面的潜力而受到广泛关注。

用于蛋白质分离的膜技术依赖于膜材料和蛋白质的性质，包括大小差异、表面电荷和相互作用。大量的研究论文集中于从水中分离蛋白质，这通常被作为一个模型系统，并且与工业中发现的非常相似。目前，超滤膜的孔径在1到100纳米之间，由于成本低和易于制造，经常使用高分子材料。这些材料的选择性可以保持在90%以上，但渗透通量通常低于1L和高跨膜压力高达1 MPa是必需的。膜材料的开发对于高通量的蛋白质分离是迫切需要的，特别是对于直径为1-10 nm且对蛋白质性质细微差异敏感的蛋白质。

开发具有窄孔径分布的先进膜层可以使蛋白质分离更加可行。为了提高膜处理的效率，人们开发了许多创新技术。在新型结构膜材料中，聚合物或杂化静电纺纤维已被用于提高膜的性能[11-18]。网状结构的高孔隙率(70%以上)和薄分离层可作为大孔支撑的顶层，在保持高选择性的同时显著提高了渗透通量。静电纺丝网的一个缺点是孔径小于100 nm很难获得，因此限制了其直接分离蛋白质的用途。而且，即使通过表面修饰改变膜的亲水性、电荷、粗糙度，或者通过引入仿生表面功能，膜污染也是不可避免的。

为了解决聚合物纤维的尺寸限制，我们率先制造了无机原纤维作为陶瓷膜的顶层，使分离层的孔径达到纳米尺度。合成的膜在几个典型应用中表现出高性能，如颗粒序列、染料降解、蛋白质分类和DNA分离[24 - 28]。这些要分离的混合物非常细，直径在1-100纳米左右。渗透通量在低于0.05 MPa的低跨膜压力下大于10L，并保持选择性大于90%。此外，这些纤维膜的表面修饰有望提供许多新的功能。因此，复合材料的纳米纤维膜通过添加光学、生物、电或磁性功能，提供了巨大的新颖应用潜力[29-33]。考虑到这一点，我们的目标是将改性纳米纤维膜应用于蛋白质分离。

本研究在多孔载体上制备了氧化铝纳米纤维膜。为了将筛分效果与纤维膜的表面性能结合起来，将硅烷基接枝在膜的纤维表面，以提高选择性，同时保持高渗透通量。采用凝胶渗透色谱法(GPC)间接测定孔径，表面接触角法测定膜表面润湿性。合成纤维膜的性能通过涉及牛血清白蛋白(BSA)、纤维素酶和胰蛋白酶的切线流动过滤来评估。定量分析了窄孔径膜性能和表面性能对膜性能的影响，阐明了影响蛋白质分离膜过滤效率的关键因素。

2.实验部分

2.1．材料

所有使用的化学物质都是商业购买的，没有任何进一步的净化。牛血清白蛋白(BSA)粉、绿色木霉纤维素酶、牛胰腺胰蛋白酶和(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)均购自Sigma Aldrich公司。来自肠膜状明串珠菌的分子量为10000、40000、70000和500000g·的右旋糖酐也是从Sigma Aldrich购买的。和乙酸均为分析级。用、和制备磷酸盐缓冲盐水(PBS)。多孔支架由南京工业大学膜科学技术研究中心提供;支架的平均孔径为0.7 mu;m，直径为30mm，厚度为2mm。

2.2. 氧化铝纳米纤维膜的合成

2.2.1薄水铝石纳米纤维的合成

采用水蒸气辅助湿凝胶转化[34]法制备薄水铝石纳米纤维。从铝盐和有机碱性溶液中沉淀出氢氧化铝凝胶;将混合物的pH值精确调整到5.0。通常，30g 溶解于100 mL去离子水中，在剧烈搅拌下滴加20%的四乙基氢氧化铵(TEAOH)溶液，控制所需pH值。白色的沉淀物通过过滤被回收。将制备好的固体湿凝胶转移到一个玻璃烧杯(25 mL)中，放入一个容量为125 mL的帕尔高压灭菌器中，在容器底部加入2ml水。高压灭菌器密封后放入烤箱。反应在170℃下进行3天。得到的湿产品用去离子水洗涤3次，用乙醇洗涤1次。制备的薄水铝石纳米纤维在500℃下煅烧5 h，转化为相进行进一步表征。

2.2.2氧化铝纳米纤维膜的合成

将制备的薄水铝石纳米纤维涂覆在载体表面。采用旋涂法(WS-400B-6NPP-Lite, Laurell)负载0.2 wt%乙醇的纳米纤维。以1000 r/min的纺丝速度将涂层涂在顶部表面，持续30秒，每层涂层使用约0.5 mL薄水铝石悬浮液[24-28]。

然后将薄水铝石纳米纤维膜置于马弗炉中，在500℃下煅烧5小时，斜温为1℃。然后将薄水铝石纳米纤维层转化为相，并紧密附着在支架表面。

2.2.3氧化铝纳米纤维膜的表面改性

引入硅烷基团对制备的氧化铝纳米纤维膜进行表面修饰。实验过程为:加入0.9 g APTES液体，将氧化铝纳米纤维膜浸入无水甲苯中。该系统的温度控制在110℃与油浴搅拌48小时。回收的膜用乙醇冲洗，并在60℃的空气中干燥。

2.3描述

采用Cu 辐射和40 kV、40 mA固定电源，在X射线衍射仪(XRD, Philips Panalytical Xrsquo;Pert Pro)上测量了粉末样品的广角X射线衍射(WAXRD)图谱。样品分析超过2，在-以每分进行。在200千伏加速电压下，使用JEOL JEM-2100透射电子显微镜获得透射电镜图像。所有样品在95%乙醇中分散，沉积在涂有碳膜的铜微网上。采用场发射扫描电子显微镜(FESEM, JEOL JSM-7001f)直接观察膜表面的形貌。采用纳米FTA200接触角分析仪对表面接触角进行分析。测试前所有样品在60℃的空气中干燥一夜。采用水相高效液相色谱法，采用RI检测器，以1 mL 速率消耗0.2 M磷酸二氢钠(0.2 M NaCl溶液;pH 7.0)，获得GPC色谱图。Waters ultra-hydrogel 120凝胶柱和线性色谱柱在30℃下串联使用。在样品分析之前建立了右旋糖酐溶液的标准曲线。

2.4纳米纤维膜的分离性能

渗透率效率最初是由蠕动泵的水通量来确定的。在本实验中，将去离子水泵入有效直径为20 mm的负载膜中，记录其流速和跨膜压力。膜的孔径分布由液-液置换法测定[35,36]。

采用标准葡聚糖溶液进行膜保留试验。截止试验选择了四种不同分子量的葡聚糖，分别为10000、40000、70000和500000 g·。以1000ppm标准葡聚糖溶液为渗透剂，稳定压力为1mpa。通过凝胶渗透色谱法(GPC)测定渗透葡聚糖溶液的浓度。通过比较渗透的葡聚糖溶液和原葡聚糖溶液的浓度来确定分子量截止值(MWCO)。

通过不同蛋白质溶液的渗透来测定膜分离效率。实验采用BSA溶液、纤维素酶溶液和胰蛋白酶溶液，对应的分子量分别为66 kDa、45 kDa和23.8 kDa(原子质量单位，1000道尔顿)。用紫外/可见光谱法测定蛋白质浓度，并在样品分析前绘制标准曲线。通过比较渗透蛋白溶液和饲喂液的浓度来确定分离效率。

3.结果和讨论

3.1. 氧化铝纳米纤维的合成

图1 显示纳米纤维的透射电镜图像，显示出清晰的一维薄水铝石结构的形貌。薄水铝石纳米纤维的直径为10 nm，长度为300 ~ 600 nm。选择性区域电子衍射表明，薄水铝石[34]具有理想的晶相，与晶格指数一致。

图1 薄水铝石纤维的TEM图像(a)和选区电子衍射(b)

图2 pH值为5.0时湿凝胶沉淀物制备的纳米纤维的XRD谱图。薄水软石纤维的所有衍射峰(图2a)都与薄水软石的标准图案匹配良好(JCPDS PDF No. 21-1307)。500℃煅烧样品的衍射峰(图2b)也与标准的模式很好地对应(JCPDS PDF No. 10-0425)，证实了相晶体的形成[37,38]。硅烷基团接枝后，衍射图谱(图2c)没有明显变化，说明接枝过程对纤维的晶相没有明显影响。

图2 (a)薄水铝石纤维(b)氧化铝纤维和(c)硅烷接枝氧化铝纤维的XRD谱图

3.2氧化铝纳米纤维膜的合成

3.2.1氧化铝纳米纤维膜的表征

FESEM图像显示了原始支架和硅烷接枝的氧化铝纳米纤维膜的表面形貌(图3)。多孔支架的表面相当粗糙，有微米级的大孔隙。在表面覆盖纳米纤维后，支架已经完全被纤维覆盖，即使原始支架的形貌仍然可以识别。放大后的图像进一步显示了表面分散良好的纤维层。氧化铝纳米纤维层极大地减少了合成膜的孔径大小，而且没有任何明显的针孔和裂纹。

图3 (a)多孔氧化铝支架膜表面的FESEM图像，(b)硅烷接枝纤维膜，以及(c) (b)局部区域的放大图像

图4给出了氧化铝纳米纤维膜的红外光谱。相对于支架的背景，接枝在支架表面的氧化铝纤维数量非常少。因此，通过刮擦硅烷接枝纤维膜的表面来收集样品，并将收集的粉末压入KBr托盘中。对于硅烷接枝的纤维膜，在2861 和2925的条带分别对应于APTES的- ch2 -不对称和对称伸缩振动(图4c)。1027和1120 处的条带代表APTES中的Si-O-C振动[39,40]。因此，红外光谱证实了硅烷基被接枝到纤维膜表面。

图4 (a)多孔氧化铝载体，(b)硅烷(APTES)和(c)硅烷接枝纤维膜的FTIR光谱

为了比较膜的润湿性能，测量了空白载体和硅烷接枝纤维膜的接触角(图5)。水接触角对于原始的多孔载体只有。相反，用硅烷基团接枝后，接触角增加到，表明获得了高度疏水的表面[41，42]。接触角分析表明，硅烷基团已经成功地接枝到纤维膜上，并将亲水表面改性为疏水表面。

图5多孔alpha;-氧化铝载体和硅烷接枝纤维膜的接触角

3.2.2 纯水通量

为了评估膜的水渗透性，在施加压力下测量水的流量。水流速是由方程求得,是水流速(), Q是渗透(水体积L),一个是有效的膜面积(),和T是采样时间(h),图6显示了水流速通过膜作为施加压力的函数。水的流量正比于所有这些膜的应用压力。在相对较低的压力下，多孔支撑具有较高的透水性，平均纯水通量接近800 L。在支架表面涂上纳米纤维后，通量降低到约360 L。将硅烷基团接枝到纳米纤维膜表面，使膜表面具有疏水性，使膜的水通量降低了一个数量级，最高可达48 L。

图6 水通过膜的流速是外加压力的函数:(a)多孔氧化铝载体；(b)c-氧化铝纤维膜和(c)硅烷接枝纤维膜。插入的图像是计算各种膜的纯水通量

为了确定影响膜过滤性能的关键因素，对纤维膜的孔径和表面性能进行了定量分析，并与硅烷接枝纤维膜进行了比较。图6显示，水流速率与施加压力(0.1 - 1.2bar)的增加成正比。假设这种趋势在施加压力范围内(小于1.2 bar)是普遍存在的，那么水流曲线可以通过计算外推到零流速。不同膜的突破压力分别为0.04 bar、0.05 bar和0.2 bar。尽管突破压力数据不是实际测量值，但孔径对膜性能的贡献一般可以根据Young-Laplace方程，其中为突破压力，为水-气界面张力，为润湿角，r为有效半径。在这种情况下，硅烷的自组装单层膜只有0.9 nm[43,44]。当有效半径为5.5 nm时，硅烷接枝后的理论半径应为4.6 nm，因此硅烷接枝纤维膜的压力仅为接枝前膜的1.2倍。然而，从图6可以看出，硅烷接枝纤维膜的突破压力是接枝前膜突破压力的四倍。因此，硅烷自组装单分子层导致的孔径缩小，只是导致了突破压力的小幅增加，这意味着另一个因素起了关键作用。这些结果表明，纯水通量的变化在很大程度上归因于合成膜的疏水表面，而孔径的变化也起了一定的作用。

3.3 纳米纤维膜的孔径分布

测试了膜的孔径分布和分离效率，结果如图7所示。原始多孔支撑的孔径分布以700 nm为中心(孔径半径如图7A所示)。通过添加纳米纤维层，它得到了显著的改进。c-氧化铝纤维膜的孔径约为11nm，与硅烷接枝的纤维膜类似(未显示)。图7B为支架、纤维膜和硅烷接枝纤维膜的分子保留曲线。根据方程:，可以计算出葡聚糖的直径，其中“”为中的分子半径，“M”为葡聚糖的分子量，单位为 [46,46]。分子量为10 kDa的葡聚糖直径为4.5 nm，分子量为40 kDa的葡聚糖直径为8.6 nm，分子量为70 kDa的葡聚糖直径为11 nm，分子量为500 kD

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