带有缺氧敏感小泡的微针阵列贴片提供了快速反应 葡萄糖反应性胰岛素传递外文翻译资料

 2022-08-04 21:27:25

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带有缺氧敏感小泡的微针阵列贴片提供了快速反应

葡萄糖反应性胰岛素传递

模拟胰腺细胞功能的葡萄糖反应的“闭环”胰岛素传递系统在改善糖尿病患者的生活质量和健康方面有着巨大的潜力。 在这里，我们报告了一种新的葡萄糖反应胰岛素传递装置，它使用无痛微针阵列贴片（“智能胰岛素贴片”），含有葡萄糖反应囊泡(GRV；平均直径为118nm)，其中含有胰岛素和葡萄糖氧化酶(GOx)酶。 该GRVS 是由缺氧敏感的透明质酸(HS-HA)与2-硝基咪唑(NI)结合而成的自组装，该疏水组分可在缺氧条件下通过生物还原转化为亲水性2-氨基咪唑。 葡萄糖在高血糖状态下酶促氧化引起的局部低氧微环境促进HS-HA的降低，迅速触发囊泡的解离和随后胰岛素的释放。 智能胰岛素贴片有效地调节了化学诱导的1型糖尿病小鼠模型的血 糖。 所描述的工作是第一次演示，据我们所知，一个合成葡萄糖反应装置使用缺氧触发器来调节胰岛素释放。 这种方法更快的反应，如果转化为人类治疗，有望避免高血糖和低血糖。

糖尿病是一组以血糖水平调节机制失效为特征的代谢性疾病（1,2）。 截至2014年，全世界有3.87亿人患有糖尿病，到2035年估计有5.92亿人（3,4）。 对糖尿病患者的传统护理往往需要监测血糖和胰岛素注射，以保持正常血糖（5）。 然而，这种自我管理与疼痛和经常不充分的葡萄糖控制有关（6- 8）。 葡萄糖控制不良导致糖尿病并发症的高风险，包括截肢、失明和肾衰竭。 此外，低血糖会导致行为和认知障碍、癫痫、意识丧失、昏迷、脑损伤或死亡（9）。

一个人工胰腺样，闭环，葡萄糖反应的胰岛素传递系统，能够“分泌”胰岛素反应血糖升高，将提供一个理想的方式来调节血糖，最小的病人努力和潜在的改善血糖和生活质量（6， 7，10）。 目前的闭环系统结合了葡萄糖监测模块和传感器触发的胰岛素释放模块（6，7）。 有闭环电子/机械设备，使用由病人校准的连续葡萄糖监测传感器和外部胰岛素输注泵（8）。 然而，与这些设备相关的挑战，如保证准确的信号反馈和防止生物污染，仍然存在。 使用含有葡萄糖传感元件和相关执行器的胰岛素负载基质的化学方法可以避免这些限制，而且可能被证明更有效的闭环控制胰岛素释放。基质可以经历由葡萄糖浓度变化调节的结构转变（即收缩、膨胀、解离)，导致葡萄糖刺激的胰岛素释放(11-14）。 典型的葡萄糖传感元件包括苯硼酸(PBA)、葡萄糖结合蛋白(GBP)和葡萄糖氧化酶(GOx)（12-20）。 尽管有这些可用的传感化学物质，大多数的现有的合成闭环系统仅在体外进行了研究，具有适用性的相对较少在 体内到期去 具体挑战为了每种葡萄糖传感策略。 例如，PBA及其衍生物以其与多元醇分子的可逆相互作用而闻名作为葡萄糖（21），但在葡萄糖和PBA之间有效的互动，伴随着随后基质的结构变化通常需要比溶液中更碱性的pH值的生理环境。PBA结合物的安全性和毒性也有待确定。Con A是胰岛素传递中最常用的GBP，通常基于其多个结合位点以及与葡萄糖和葡聚糖基质的竞争性相互作用(22)。然而，已证实的Con A的体内毒性和不稳定性限制了其临床应用（23）.Gox是一种可以在有氧的情况下将葡萄糖转化为葡萄糖酸：

意义：

利用GOx的葡萄糖反应系统总是与pH敏感材料集成，这些材料要么是经质子化或降解，局部pH值降低，通过增加葡萄糖浓度而促进。为了开发合成的葡萄糖反应性胰岛素输送系统，仍然需要证明一种结合（i）快速反应性，（ii）给药方便性和（iii）优良生物相容性的策略。我们开发了一种新的葡萄糖反应胰岛素传递装置，使用无痛微针阵列贴片含有缺氧敏感的透明质酸基囊泡。小泡在局部缺氧环境下迅速解离并释放包裹胰岛素，这是葡萄 糖在高血糖状态下的酶氧化所致。这种“智能胰岛素贴片”具有一种新的基于酶的葡萄糖反应机制，可以调节1型糖尿病小鼠的 血糖达到正常水平，与常用的pH敏感制剂相比反应更快，并能避免低血糖的风险。

图1.利用缺氧敏感囊泡负载MN阵列贴片的葡萄糖响应性胰岛素递送系统的示意图。（A） HS-HA组成的GRVs的形成及其机制。（B） 含GRV的MN阵列贴片（智能胰岛素贴片）示意图，用于高血糖状态触发的体内胰岛素输送，以释放更多胰岛素。

然而，这种依赖于pH值降低的方法往往因反应缓慢而受到损害，特别是在缓冲的生理环境中（8）。综上所述，证明一种结合（i）快速反应性和类似于正常胰腺活动的药代动力学，（ii）易于给药，以及（iii）无长期副作用的生物相容性（3）的方法仍然是一个挑战。

在这里，我们报道了一种新型的基于微针（MN）阵列贴片的葡萄糖敏感型胰岛素释放装置，该贴片与含有胰岛素和GOx的缺氧敏感透明质酸（HS-HA）囊泡相结合。我们所知，我们第一次利用酶反应中氧的消耗而产生的局部缺氧，作为胰岛素快速释放对高血糖反应的触发，而不是使用酶诱导的pH变化（3，8）。为了实现缺氧反应性转导，使用了2-硝基咪唑（NI），一种疏水性成分，由于其对肿瘤部位缺氧条件的高度敏感性而经常应用于癌症成像（24，25）。在缺氧环境下，NI通过一系列硝化还原酶与生物还原剂的耦合，通过单电子还原反应，可转化为亲水性2-氨基咪唑，例如NADPH，一种组织中丰富的辅酶（24-27）。我们将胺官能化NI与HA（分子量为300 kDa）偶联，众所周知HA具有良好的生物相容性和生物降解性（28–30）。如图1A所示，通过自组装，两亲性HS-HA可以容易地形成在水溶液中封装重组人胰岛素和GOx的纳米级葡萄糖响应囊泡（GRV）。在高血糖条件下，葡萄糖（3，10）催化葡萄糖氧化，使溶解氧迅速消耗，形成局部缺氧环境。在生物还原条件下，HS-HA上的NI基团被还原成亲水性的2-氨基咪唑，导致GRVs的解离和胰岛素的释放。

为了实现给药的方便性，我们进一步将GRV加载到MN阵列贴片中，用于无痛（31-34）胰岛素递送(图。 1b)。 用交联HA 制备MNS基体，以提高MNS的刚度，限制针间GRV的损失。 通过经皮给药，当暴露于血管和淋巴毛细血管网络中的高间质液体葡萄糖时，负载在MNS中的GRVs被分解（35)，从而促进胰岛素的释放，然后通过区域淋巴和毛细血管吸收(36）。 我们证明，这种“智能胰岛素贴片”具有一种新的葡萄糖反应机制， 显示出对葡萄糖的快速反应调节和可靠避免1型糖尿病小鼠低血糖模型。

结果

GRVs的合成与表征：将重组人胰岛素和GOx包埋在核内，通过HS-HA自组装形成grv。HS-HA是通过与胺官能化NI形成酰胺键分三步得到的（图S1）。疏水性NI基团的掺入使得衍生的HA具有两亲性，从而能够在水溶液中形成GRV（37，38）。此外，NI提供了一种低氧敏感元件，有望在缺氧条件下被生物还原（24，27）。带有胺基的还原产物是水溶性的，导致GRV的分解。如透射电子显微镜（TEM）图像所示（图.2A），得到的GRV呈球形，大小为单分散。通过动态光散射（DLS）测定GRV的平均直径为118 nm（图2B），这与TEM观察结果一致。由于HA的残留羧基，GRVs的zeta电位测量值为minus;34.7plusmn;0.4 mV。FITC标记胰岛素的GRVs荧光图像进一步证实了胰岛素的成功包封（图2D）。这个GRVs的胰岛素载量为8.7%（wt/wt）。重要的是，获得的GRV高度稳定，在4℃下1个月内未观察到明显的沉淀。

GRVs的体外葡萄糖反应性胰岛素释放：为了检测GRV的葡萄糖反应性分解，将囊泡与含有不同浓度葡萄糖的PBS缓冲液[137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2HPO4、2 mM KH2PO4（pH 7.4）]孵育，包括典型的高血糖水平（400 mg/dL）、正常血糖水平（100 mg/dL）和对照水平（0 mg/dL）。用氧敏磷光分子探针（39，40）测定了GOx催化葡萄糖氧化所引起的耗氧量。如图2F所示，与其他两个对照样品相比，暴露于高血糖溶液中的样品具有较低的氧浓度。注：10分钟内达到平衡，表明此时耗氧速率与溶解速率达到平衡.记录的含400 mg/dL葡萄糖溶液的孵育溶液的pH值随时间稳定下降（图S2），进一步证实了葡萄糖在GOx催化下转化为葡萄糖酸。在这种情况下还原酶催化NADPH产生的电子能有效地还原HS-HA的硝基。通过测量A330（41）处NI特征峰的紫外-可见（UV-Vis）吸收强度，实时监测NI的残留浓度。

图2.GRV的特性。（A） GRV包裹胰岛素和酶（i）与400 mg/dL葡萄糖预孵育或拔管后（ii）20min的TEM图像，（iii）1h和（iv）24 h（刻度条：200 nm.）GRV预孵育（B）和管后（C）与400 mg/dL葡萄糖24 h的尺寸分布。荧光2.5D在37°C（F）磷光寿命下，FITC胰岛素负载GRV溶液预孵育（D）和拔管后（E）在400 mg/dL葡萄糖溶液中1h的图像在含氧浓度分子探针的不同葡萄糖浓度溶液中孵育GRV的时间分布。（G） 紫外线监测在37°C下，不同葡萄糖浓度下，A330下GRV的吸收强度。误差栏表示SD（n=3）。a、 美国，任意单位。

如图2G所示，与400mg/dL葡萄糖溶液孵育的grv的相应吸收强度随时间逐渐降低，提示疏水性NI基团以胺基取代。与此形成鲜明对比的是，在与100 mg/dL葡萄糖溶液相关的样品中观察到吸光度强度的缓慢下降，而在没有葡萄糖的对照样品中没有观察到下降。此外，通过TEM成像和DLS可以清楚地观察到相应的构象演变和尺寸变化（图2A和C）。验证进一步，将FITC结合的胰岛素包封到GRVs中。如图2E所示，GRV悬浮液暴露于葡萄糖1h后荧光信号分布更均匀，而原GRV悬浮液显示大量簇状信号，验证FITC胰岛素的释放。

由于GRVs解离，从典型高血糖水平为400 mg/dL葡萄糖的样品中获得显著快速的胰岛素释放曲线，而在PBS溶液中，只有少量的胰岛素从GRVs中释放，没有或相对正常的100 mg/dL葡萄糖水平（图。3A）。为了验证胰岛素释放速度是否直接对应于氧水平导致的NI基团减少而不是pH水平降低，我们研究了ph4.0溶液中胰岛素释放动力学。结果表明，在pH值为4.0的溶液中孵育的样品中胰岛素释放不明显，证实GRV在酸性条件下是稳定的（图S3）。此外，通过改变葡萄糖浓度观察到胰岛素的可变动力学释放曲线（图3B）。当葡萄糖浓度从100毫克/分升改变到400毫克/分升时，胰岛素释放率在20分钟内达到6.6倍的最大差异。相比之下，含有一半GOx量的GRVs由于相对较慢的耗氧速率而显示出较慢的释放速率，这表明可以通过改变酶的包封剂量来调节胰岛素释放速率。此外，当每隔20分钟在正常和高血糖状态之间交替暴露数个周期时，GRV的胰岛素释放曲线呈现脉动模式（图3C）。重要的是，与现有的合成葡萄糖反应系统相比，GRV对葡萄糖浓度的变化反应迅速（3，8）。例如，低氧敏感性GRV对高血糖水平的反应速度明显快于先前报道的具有相同酶量的pH敏感性葡萄糖反应配方（19）（图S4）。这一发现可以归因于局部缺氧微环境引发的制剂解离的结构转化点的获得比局部酸性环境更快。以上讨论的结果证实GRV的分解和胰岛素的释放经历了葡萄糖介导和缺氧依赖过程。此外，CD谱显示GRVs释放胰岛素（0.1mg/mL）的二级构象结构与天然胰岛素相比没有变化（图3D）。

GRV负载MN阵列贴片的制备与表征：为了方便给药，我们接下来制作了一种含有GRVs的MNarray（32，34，42）贴片，作为一种无痛的一次性胰岛素给药方式（32）。简单地说，首先通过离心将GRV装入MNs的硅酮模具的尖端，然后逐滴添加含有甲基丙烯酸HA、交联剂N，Nrsquo;-亚甲基双丙烯酰胺和光引发剂的溶液（图4A）。在紫外光照射下，HA基质被光交联以增强MNs的硬度并将GRV包埋在针头中。将得到的MN排列成11times;11阵列，面积为6times;6 mm，并在使用医用胶带搬运期间进行支撑以保持稳定性（图4B）。每根针都是圆锥形的，底部半径为150mu;m，高度600mu;m，尖端半径sim;10mu;m（图4C）。图4D显示了含有FITC胰岛素负载GRV的代表性MN的荧光

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