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浊点系统中全细胞微生物转化
Zhilong Wang · Jian-He Xu · Daijie Chen
摘要 由水溶液中的非离子表面活性剂组成的浊点系统已被开发为一种用于全细胞微生物转化的新型培养基。 介绍了浊点体系的基本性质，包括相分离和增溶作用。 本文讨论了浊点系统在萃取性微生物转化中的应用与水-有机溶剂两相分配系统或水相两相系统的应用不同，主要着眼于微生物在浊点系统和下游过程中的生物相容性。 油-水表面活性剂微乳液液液萃取在浊点体系中进行微生物转化以回收表面活性剂和分离产品 最后，还给出了浊点系统中全细胞微生物转化的例子，特别是中度极性底物/产物的原位提取。
关键词 微生物转化·非离子表面活性剂·浊点系统·两相分配系统
引言
与分离的酶相比，全细胞作为生物催化剂的应用通常由于其自然环境的周围而更加稳定，而由于消除了乏味的蛋白质纯化过程而更加经济。此外，廉价葡萄糖的全细胞代谢足以驱动涉及辅因子再生的生物过程中的反应[1]。因此，在生物合成过程中，全细胞作为生物催化剂比分离的酶更为普遍[2]。诸如组学工具（基因组学，转录组学，蛋白质组学和代谢组学）之类的新兴生物技术领域将导致越来越多的高产菌株。然而，除了结构之外，全细胞微生物的生化系统还具有动态和调节特性。例如在水溶液中进行全细胞微生物转化时，存在一些障碍，包括由于大多数疏水性有机化合物的低水溶性导致底物对微生物的可及性有限，底物和产物对微生物的抑制或毒性以及可能性整个细胞对产物进一步降解的影响[3]。生物降解中也发生类似的过程[4-6]。生物工艺技术在处理动态和调节特性方面的改进应与上游发展保持同步。
微生物转化介质从水溶液到有机溶剂，尤其是水-有机溶剂两相分配系统的转换已得到广泛研究[7-10]。在有机溶剂中进行全细胞微生物转化的主要障碍之一是其生物相容性，这导致了对有机溶剂耐受性微生物的筛选。审查了有机溶剂耐受微生物的筛选及其耐受机制[11-14]。例如，已证明耐有机溶剂的恶臭假单胞菌可在高浓度的甲苯中壮成长[15]。其他例子包括从大肠杆菌K-12制备耐有机溶剂的突变体[16]，在无水有机溶剂中利用疏水性细菌不透明红球菌B-4作为全细胞催化剂[17]。或者，最近也引起了人们对除有机溶剂以外的生物相容性非水溶剂（称为介质工程）的选择的关注，例如水两相系统[18，19]和室温离子液体[20，21]。浊点系统作为一种新型的两相分区系统已应用于分离焊缝中，并被称为浊点提取[22-26]。在我们的实验室中，浊点系统也已成功用于全细胞微生物转化[27]。浊点系统作为一种新型的生物转化介质的潜在应用也得到了叙述[28]。在当前的工作中，介绍了有关浊点系统的基础知识，包括相分离和增溶作用。然后讨论了将浊点系统应用于提取性微生物转化的生物过程考虑因素，例如生物相容性和下游过程。最后，还介绍了浊点系统中微生物转化的例子，特别是中度极性底物/产物的原位提取。
浊点系统
相分离
表面活性剂浓度高于其临界胶束浓度（CMC）的表面活性剂水溶液通常会自行组装成许多种超分子组装体，例如胶束，层状，囊泡，反胶束，六方晶和液晶体等。在一定温度以上或在某些添加剂存在下，发生相分离以形成稀相和富含表面活性剂的相或凝聚层。非离子表面活性剂Triton X-100水溶液的相分离取决于温度，如图1所示[29]。稀相是表面活性剂胶束溶液，其表面活性剂浓度高于其临界胶束浓度。凝聚相中的表面活性剂可形成层状或囊状结构，这取决于表面活性剂的分子结构和温度。这样的两阶段分区系统称为浊点系统。相分离温度称为浊点。浊点由所用非离子表
面活性剂的分子结构决定[30]，并且还受表面活性剂浓度和添加剂的影响。在一些评论文章中对此进行了详细介绍[23,24,26]。
应强调区分浊点现象和可在水溶液中分散的表面活性剂。当环境温度处于表面活性剂水溶液的KraVt点时，表面活性剂的溶解度等于其临界胶束浓度。高于Krafft点，由于形成胶束，表面活性剂的总溶解度急剧增加。低于Krafft点，仅存在表面活性剂单体，并且溶解度受到极大限制。因此，表面活性剂水溶液在低于其Krafft点的温度下是浑浊的，但是在高于其Krafft点的
温度下变得澄清[31]。图2显示了3％（v/v）Triton X-45在水中可分散的相变。图2所示。非离子表面活性剂可在水溶液中分散，并在室温下形成白色可分散相。随着温度的升高，浑浊的可分散相变得澄清，并且随着温度的进一步升高至其浊点而再次变得浑浊。但是，在室温下可分散在水溶液中的表面活性剂的浊度通常被认为是浊点现象，低于室温的Triton X-45被认为是浊点[23]。尽管在室温下不会在浊点温度下发生两相分离，但非离子表面活性剂Brij 30和Span 20等[23、32]仍存在相同的现象[33]。
商业上有许多非离子表面活性剂，但是，在室温（约20–40°C）下具有浊点的非离子表面活性剂用于提取浊点非常有限。已经证明，聚乙二醇（PEG）对表面活性剂水溶液的浊点的影响与聚合物的链长有关。具有短链的聚合物提高了非离子表面活性剂溶液的浊点。另一方面，具有长链的聚合物降低了非离子表面活性剂溶液的浊点。已经提出了关于存在于两个规则胶束之间的聚合物链的一种可能的絮凝耗竭机制，以解释聚合物与表面活性剂的相互作用[34]。也已经报道了聚乙烯吡咯烷酮[35]，beta;-环糊精[36]和羟丙基淀粉Repppal PES100 [37]对非离子表面活性剂水溶液的浊点的影响。如图3所示，可以通过添加长链PEG 20000来诱导浊点为68°C的非离子表面活性剂Triton X-100水溶液形成浊点系统，其中一个是富含非离子表面活性剂的相，另一个是富聚合物相[38]。相图给出了每个相的确切组成，这与常规的水性两相系统相似。 PEG诱导的浊点系统使大多数商用非离子表面活性剂在室温下用于浊点萃取成为可能。
增溶
增溶被定义为“通过引入另外的两亲化合物或组分，制备通常不溶于或非常难溶于给定溶剂的物质的热力学稳定的各向同性溶液” [39]。已经全面研究了溶质在表面活性剂胶束中的溶解机理，例如在胶束疏水核中溶解的烃类添加剂，在栅栏区域定向的极性更大的材料，在水合层区域溶解的极性添加剂和直接添加的添加剂。不仅与疏水性溶质而且亲水性溶质也可以被溶解成表面活性剂胶束。极性化合物，特别是具有氢键官能团的化合物和具有C–H ...pi;相互作用的芳烃，也被发现可以溶解[41]。表面活性剂胶束水溶液的增溶和非离子型表面活性剂水溶液的相分离使浊点体系成为重要的分离介质，在分离领域被称为浊点萃取[23]。
浊点提取技术在分离领域已有很长的历史，近年来作为一种生态友好的方法受到越来越多的关注[26]。然而，在浊点系统的凝聚相中增溶的研究相对较少。主要障碍是难以确定自由溶质的浓度，即区分表面活性剂超分子组装体和水溶液中的溶质。水溶液中非离子表面活性剂的超分子组装的不同类型导致其增溶能力的多样化。苯酚浓度极低的严格实验表明，非离子表面活性剂在稀相和凝聚相之间的增溶能力很小，差异可归因于实验误差[42]。然而，如图4所示，已经确定了浊点系统凝聚相中苯酚溶解度随苯酚浓度的增加而发生了显着变化[43]。凝聚层中超分子组装体的结构通过添加苯酚来改变，以降低非离子表面活性剂水溶液的浊点，这类似于超分子组装体随着温度的升高而从层状变为囊泡结构[44]。增溶能力的差异可归因于凝聚相中超分子组装的不同结构。在非离子表面活性剂Brij 35的浊点体系中也有类似现象的报道，溶解的苯酚从稀相的每摩尔表面活性剂2.9摩尔增加到凝聚相的每摩尔表面活性剂7.5摩尔[45]。浊点系统在稀相和凝聚层中的不同溶解能力进一步证实，溶解与非离子表面活性剂的超分子组装体的结构有关。
生物工艺考量
水-有机溶剂两相分配系统[8]和水两相系统[18,19]已用于提取微生物转化。然而，水-有机溶剂两相分配系统的生物相容性和水两相系统的下游工艺在工业应用上受到限制。本节将讨论浊点系统在全细胞微生物转化中的生物相容性和下游应用过程。
生物相容性
非水介质的生物相容性是其应用于全细胞微生物转化的前提条件。一些表面活性剂浓度相对较低的非离子表面活性剂胶束溶液已被用于提高疏水性化合物的生物利用度[46-48]。然而，非离子表面活性剂对微生物细胞的渗透性使非离子表面活性剂对微生物有毒[49]。
在不同种类的非离子表面活性剂水溶液中分枝杆菌sp.的筛选发现，只有浊点低于培养温度且发生相分离以形成稀相和凝聚层的Triton X-114是生物相容的。非离子型表面活性剂Brij 30与图2中讨论的Triton X-45一样可分散于水溶液中，并且浊点高于培养温度的表面活性剂也对微生物有毒[27]。进一步研究了非离子表面活性剂水溶液的生物相容性与相分离之间的关系。相同系列的非离子表面活性剂Triton X-100，Triton X-114和Triton X-45，具有相同的疏水部分，但环氧乙烷单元的数目不同。 Triton X-114具有生物相容性，但Triton X-100对微生物分枝杆菌sp有毒，如图5a所示。尽管疏水底物可以用任何比例的Triton X-114与Triton X-100溶解，但仅在一定体积比的Triton X-114与Triton X-100之间溶解，浊点在培养温度以下，该系统是具有生物相容性[27]。 Triton X-114与Triton X-45的比率不同的一系列混合表面活性剂的相分离和生物相容性如图5b所示。
仅在Triton X-45与Triton 114的体积比低于40％时发生相分离。高于这些体积比时，混合非离子表面活性剂水溶液的Krafft点高于微生物培养温度，然后相分离只能在更高的温度下进行，如图2所示。微生物酿酒酵母和在一系列非离子表面活性剂水体系中生长的酿酒酵母生物量也与相分离一致[50]
聚乙二醇（PEG）诱导Triton X-100水溶液形成新的浊点系统，如图3所示。在不同的水-有机溶剂中，对PEG诱导的浊点系统与浊点系统的生物相容性进行了比较研究2相分配系统如表1所示。累积的生物量和残留的葡萄糖用于量化非水系统的生物相容性。在有机溶剂介导的水-有机溶剂两相分配系统中，生物相容性随log P的增加而增加（log P定义为辛醇和水之间的分配系数，通常用于指示有机溶剂的极性log P准则[8]所预测的有机溶剂）。非离子表面活性剂的浊点系统比水-有机溶剂两相分配系统的极性更强，这已基于ET（30）进行了讨论[28]。然而，酿酒酵母在PEG诱导的浊点系统以及浊点系统中保持其生物相容性，这提供了具有相对较高极性的生物相容性环境。
在相分离条件下，有毒非离子表面活性剂与微生物具有生物相容性。浊点系统的生物相容性与水-有机溶剂两相分配系统具有相似的原理[4,14,51,52]。不同之处在于，水-有机溶剂两相分配系统中的有机溶剂辅助相被浊点系统中的凝聚相取代.浊点系统的微观结构和在浊点系统[27]中进行微生物转化的推测机理如图6所示。
众所周知，大多数有机溶剂对微生物有毒。 单相有机溶剂系统已应用于微生物转化[53]，其中只能添加有限浓度的有机溶剂以增加某些有机底物的溶解度。有机溶剂对微生物的临界抑制浓度随有机溶剂极性的增加而增加[8,14]。 然而，在水-有机溶剂两相分配系统中，有机溶剂对微生物的毒性取决于其在水环境中的实际浓度，而不是总有机溶剂的浓度。广为接受的log P标准表明log P大于4的有机溶剂具有生物相容性[7,8,54]。
类似地，有毒的非离子表面活性剂在高于其浊点的温度下浓缩进入凝聚层，而稀释相中的表面活性剂浓度相对较低。一种非常低的非离子表面活性剂胶束溶液具有生物相容性，已在生物技术中得到应用[46-48]。选择类似于log P作为有机溶剂的参数，非离子表面活性剂的浊点可以用作非离子表面活性剂的标准。然而，在浊点体系中用非离子表面活性剂代替辅助相具有一些优点。例如，非离子表面活性剂的不挥发和不易燃性满足了绿色溶剂的需求，避免了在有氧条件下水-有机溶剂两相分配系统中存在的爆炸危险[55]；如表1所示，在浊点系统中非离子表面活性剂的相对较高的极性和生物相容性对于中等极性底物/产物的全细胞微生物转化具有潜力，而水-有机溶剂两相分配系统则无法获得，因为生物相容性和产品提取不能同时实现[56，57]
下游流程
非挥发性非离子表面活性剂是一种环境友好的溶剂[26]，使得从浊点系统微生物转化过程中回收的产物无法像常规水-有机溶剂两相萃取那样复制常规蒸发程序。除了繁琐的色谱分离[58]，只有很少的报道涉及从特殊目标化合物中大规模分离非离子表面活性剂。例如，与只能提取中性溶质的水相两相系统一样[59]，已经提出了调节浊点系统的pH值以利用酸性或碱性部分反萃取溶质的方法[ 24]。文献[60]也记录了通过全蒸发从表面活性剂溶液中回收挥发性有机化合物的情况。在蛋白质的浊点萃取后，将共聚物EOPO添加到凝聚层中形成了一个新的两相系统，该系统中蛋白质由于其强大的排斥作用而分配到水相中。这种现象已被用于从非离子表面活性剂中分离目标蛋白[37]。 Winsor II微乳液已成功用于从非离子表面活性剂溶液中分离亲水性胆固醇氧化酶[61]。产物分离和非离子表面活性剂回收的通用策略的发展对于浊点系统的工业应用是必不可少的。
微乳液由水，有机溶剂和表面活性剂组成，有时还以醇为助表面活性剂。两相系统分别称为Winsor I和Winsor II，分别对应于与过量油相共存的水包油微乳液和与过量水相共存的油包水微乳液。 Winsor III系统使表面活性剂浓缩成双连续相，并与过量的油和过量的水共存。有时，水，表面活性剂和有机溶剂会形成单相，也称为Winsor IV。如表2所示，
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