用于骨再生的自修复丝素蛋白基水凝胶：动态金属-配体自组装方法外文翻译资料

 2022-08-06 14:37:38

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用于骨再生的自修复丝素蛋白基水凝胶：动态金属-配体自组装方法

石立洋，王凡璐，朱伟，*许宗璞，萨宾·富克斯，乔恩·希尔伯恩， 朱良军，马琦，王英杰，翁喜生，*和德米特里·奥西波夫*

1. 简介

尽管基于丝素蛋白（SF）的水凝胶的开发取得了进展，但目前用于SF凝胶化的方法仍显示出明显的局限性，例如缺乏可逆的交联，使用非生理条件以及控制凝胶化时间的困难。在本研究中，开发了一种基于动态金属-配 体配位化学的策略，可在生理条件下在SF超细纤维（mSF）和多糖粘合剂 之间组装基于SF的水凝胶。提出的基于SF的水凝胶具有剪切稀化和自动自我修复的特性，从而能够将不规则形状的组织缺损清除而不会造成凝胶碎裂。生物矿化方法用于生成磷酸钙包衣的mSF，其被粘合剂的双膦酸酯配 体螯合形成可逆的交联年龄。通过粘合剂的丙烯酰胺基团的光致聚合，可以获得坚固的双交联（DC）水凝胶。基于DC SF的水凝胶可在体外支持干细胞增殖，并在颅骨临界大小缺损中加速骨再生，而无需提供任何其他形态发生子。发达的可自我修复和可光聚合的SF基水凝胶具有可注射性和ft

-to-shape成型的优势，具有潜在的骨再生应用潜力。

响应于对骨骼组织修复和置换的大量临床需求，借助骨诱导性生物材料的骨组织工程学

（BTE）出现了，从而革新了传统的骨缺损再生策略。目前，用于BTE的生物材料主要分为两类：陶瓷基配方和基于合成或天然聚合物的配方，或这两类的组合（混合材料）

。[1,2]聚合物基骨支架由于其易于功能化

，可调节的生物降解和生物相容性的可能性而被广泛用于骨再生。[3,4]特别地，基于聚合物的或复合的水凝胶具有临床应用的优势，因此具有临床应用价值。被注射。具有可适应骨缺损轮廓的能力的可注射水凝胶支架非常适合通过使预制的支架适应缺损来预防周围组织损伤的医学并发症，从而缩短手术时间并减少术后疤痕的大小。[5– 7]体内可注射水凝胶的重要标准是聚合物的原位交联，即（1）在生理条件（温度，pH）的水性介质中，（2）不使用有害的交联剂或释放有毒的副产物。

L. Shi，J。Hilborn教授，DA Ossipov教授生命科学实验室

乌格萨拉大学化学系高分子化学系

瑞典乌普萨拉75121

电子邮件：dmit ri.ossipov@kemi.uu.se

F. Wang，S。Fuchs教授实验性创伤手术

英国石勒苏益格荷尔斯泰因大学医学中心英国基尔24105 朱伟博士大手术科

北京协和医院

中国医学科学院北京协和医学院北京100730

电子邮件：zhuwei9508@163.com

徐中，朱立教授

动物科学应用生物资源研究所浙江大学杭州310058

王，翁X.教授

北京协和医院中国医学科学院北京协和医学院北京100730 电子邮件：xshweng@medmail.com.cn

DOI: 10.1002/adfm.201700591

（3）以足够快的速度提高临床疗效，但速度又慢到足以适当混合和注射。[8]尽管为 BTE 开发了许多可注射的水凝胶，但这些物质的凝胶化是通过物理或化学方法引发的[9,10]设计一种可以凝胶形式注射并经过改造以适合所需的骨缺损几何形状的材料，同时又可能存在类似的问题注射前后的机械性能可能会解决此问题。尽管过去十年来人们对自愈水凝胶的兴趣日益浓厚，这种水凝胶可以在受损后恢复其结构，但对其在骨再生中的应用的研究仍然很少[11]。

在许多聚合物材料中，天然纤维蛋白丝素（SF）由于其令人印象深刻的生物相容性，强大的机械性能，最小/非免疫原性和可调节的生物降解性，显示出BTE的巨大潜力[12-14]。SF也是一种FDA批准了某些生物医学装置（例如缝合线）的材料，表明其对人体的安全性[15，16]。已开发出多种形式的SF生物材料，包括flms，电纺纳米纤维，海绵和水凝胶，并用作骨骼再生的支架[17,18]。此外，基于SF的材料与其他有机和/ 或无机生物材料结合形成复合材料，从而提供了一种多功能的工具箱，并允许针对特定的生物医学应用调整SF[18]。尽管存在许多固体SF支架，但可注射SF水凝胶的优势在于可以轻松填充不规则形状的骨缺损，而无需事先成型材料的形状。[19,20]SF 水凝胶是从 SF 获得的蛋白质构象从无定形转变为分子间 beta;-折叠的溶液的蛋白质构想通常从数小时到数月不等[21]。

在生理条件下无任何化学和物理刺激的情况下，在生理条件下原位组装基于SF的水凝胶提供了一般策略。以及多糖粘合剂（图1）。为了通过金属离子与 BP 的配位作用使 mSF 相互作用，我们使用生物启发的矿化方法在其上覆盖了一层磷酸钙（CaP）颗粒（图 1）。使用1-乙基-3-（3-二甲基-氨基丙基）碳二亚胺（EDC）-偶联和硫醇-二 硫键交换反应合成具有化学连接的 BP 基团的多糖粘合剂。预期聚合物粘合剂的 BP 配体会在获得的 CaP 包覆的 mSF（CaP @ mSF）的表面上螯合 Ca2 离子，从而产生动态的基于 SF 的水凝胶（图 1）。此外，我们设计了一种带有光可交联基团的多糖粘合剂，以提高自愈基于 SF 的水凝胶在紫外线下的机械性能（图 1）。进行了细胞活力 实验，以评估新材料的生物相容性并确认其支持干细胞生长的能力。 由于由蛋白质纤维，CaP 微结构矿物质和多糖胶组成的水凝胶独特的层次结构，我们假设它可以在不使用外源性生长因子的情况下作为一种有效的骨再生支架发挥作用。为了证明这一点，将由 SF 制备的复合支架植入直径为 8mm 的大鼠颅骨关键缺损中，并在植入后 4 和 8 周对动物进行检查。

已使用了几种物理刺激，例如剪切应力[22-25]。暴露于CO2[26]， 2. 结果和讨论

有机溶剂和离子，[27,28]聚合物，[29]表面活性剂，[30]低pH，[21]和高温[31]可以减少胶凝时间。尽管疏水性beta;-折叠层的形成为水凝胶网络提供了长期稳定性，但也会导致形成的水凝胶变脆。[32]此外，使用有毒的化学刺激剂（酸，盐，醇和表面活性剂)和其他刺激（例如热量）不适合将细胞/敏感的生物分子（生长因子）掺入这些水凝胶中，这也限制了它们在组织工程中的应用。最近，一些化学交联方法被用于解决上述限制。尤其是，可注射的弹性体 SF 水凝胶是通过辣根过氧化物酶（HRP）催化的丝上酪氨酸基团的交联制备的。[33–35]但是，与许多其他化学交联的水凝胶相似，HRP 催化的SF 水凝胶在流动过程中无法流动。 [36]目前，开发具有剪切稀化和自修复特性的可注射SF水凝胶仍然是一个挑战。

在触变性网络[37,38]的设计中采用了动态的金属-配体配位，包括 含邻苯二酚的聚合物与三价铁离子之间的贻贝激发的动态相互作用。[39,40]然而，它们的形成条件远非生理条件（例如碱性 pH），限制了它们在组织工程中的应用。在这项研究中，我们基于SF微纤维（mSF）之间的动态金属·双膦酸酯（BP）配位键，

    1. mSF 的制备和 CaP 涂层

根据我们以前的报道[41,42]，采用“自顶向下”方法直接从宏观丝纤 维中获得了长度为 200–300 micro;m 且直径约为 10 micro;m 的 mSF（图 S1， 支持信息）[41,42] mSF 是通过生物矿化作用完成的，即将微纤维浸入

1.5 升模拟体液（SBF）中 7 d（图 1）。傅里叶变换红外光谱（FTIR） 用于鉴定 CaP @ mSF 和 mSF 的分子结构（图 2a）。SF 官能团，酰胺I（C = O 拉伸），酰胺 II（C = N 拉伸和 N = H 变形）和酰胺 III

（C = N 拉伸和 N = H 变形）的特征在于 1645、1516 处的峰分别为1230 cm 1 和[42]。[42]用 CaP 包被后，酰胺 I 峰移至 1630 cm 1 处的较低波长，从而表明 Ca2 离子与羧基之间的相互作用。磷酸基团的[43]O P O 弯曲振动由 567 和 603 cm 1 处的强烈峰指示，而 1035 cm 1 处的峰则归因于 O P 拉伸振动。[42]使用 mSF 和纯羟基磷灰石

（HAP）作为对照，通过 X 射线衍射（XRD）测量分析了沉积矿物的晶体学性质（图 2b）。在20.7° 处的宽峰归属于丝蛋白的beta;-折叠晶体结构域。它表明了 mSF 的内部结构井井有条。[44]生物矿化 7 天后，观察到的峰分别为 25.90°，31.82°，39.85° 和 53.20°，分别与（002），（211） ，（130）和（004）晶格平面相对应。除了 FTIR 和 XRD数据外，通过扫描电子

图 1.用于骨骼再生的基于 SF 的自愈水凝胶的制造示意图。采用生物矿化法制备了磷酸钙（CaP）包被的 mSF（CaP @ mSF）。随后通过与生物聚合物粘合剂简单混合来固定 CaP @ mSF，以形成基于 SF 的自愈（Am-HA-BP·CaP @ mSF）水凝胶。在将物理水凝胶暴露于紫外线后，形成了坚固的双交联（DC）Am-HA-BP·CaP @ mSF 水凝胶。将基于 DC SF 的水凝胶植入大鼠颅骨关键缺损中，以评估其骨再生能力。

显微镜（SEM）证实了 mSF 表面上矿物相的形成。在微纤维表面观察到花状微球（图 2d）。这些微球在不同的方向上显示出许多纳米级的晶体板。根据热重分析（TGA），温度从 50 升高到 550 C 后，仍保留 52 wt％的 CaP @ mSF 样品，而 mSF 样品的残留质量仅占初始样品质量的 16 wt％（图 2c ）。同时，在此温度范围内，HAP 组几乎未检测到质量损失（图 2c）。根据 TGA 分析的结果，我们可以估计 CaP @ mSF 材料的无机链段的质量百分比为35％。总而言之，FTIR，XRD，SEM 和 TGA 分析明确证实了用 CaP 成功完成 mSF 的表面涂层。与纯 HAP 相比，发现结晶度较弱的 CaP @ mSF 的结构类似于天然骨矿物质，具有很大的 BTE 潜力。[42,45]

    1. 生物聚合物粘合剂的合成

基于天然聚合物透明质素的生物相容性，生物降解性和非免疫原性，选择了天然聚合物透明质酸（HA）作为制备粘合剂的原料。用BP基团修饰HA大分子，以作为结合剂来螯合CaP @ mSF 表面上存在的Ca2 离子。 HA修改分两个步骤完成（图3）。在第一步中，天然EHA通过EDC偶联反应用2-二硫代吡啶基（- SSPy）基团进行化学修饰，以提供相应的HA-SSPy衍生物。 HA

-SSPy的结构已通过在1H-NMR光谱中的7.45、7.92、8.06和8. 45 ppm处出现新峰的方式得到验证（图S3，支持信息）。其次

，使用HA-SSPy衍生物与接头2之间的硫醇-二硫键交换反应， 将BP基团与HA偶联（图S3，支持信息）。硫醇-二硫键取代反应具有化学选择性，可提供高保真度和高效率的BP共轭。 BP 修饰的透明质酸-罗南生物聚合物（HA-BP）的结构通过1H-NMR 进行了验证，结果表明与巯基吡啶基离去基团的质子相对应的峰消失了，并在2.18 ppm处出现了一个新峰（图S4a，支持信息） 。

归因于与BP桥接碳相邻的亚甲基质子（= CH2C（OH（PO3H2）2）。此外，在2.5和3.2ppm之间的范围内鉴定出了与BP和HA骨架之间的连接基的10个亚甲基质子相对应的新峰

（OCH2CH2SSCH2CH（OH）CH（OH）CH2SCH2CH2C（O）NH 3）。通过比较在2.18 ppm处的峰的积分值与在1.9 ppm处的乙酰胺部分的积分值，计算BP的修饰度。修饰度为17％，相当于- SSPy基团被接头2几乎定量取代（94％）。

图 2. CaP @ mSF 的表征。a）FTIR 分析，b）XRD 分析和 c）TGA 用于表征 CaP @ mSF（红色光谱和曲线）。mSF（蓝色光谱和曲线）和纯羟基磷灰石（黑色光谱和曲线）用作对照。d）CaP @ mSF 样品的SEM 图像显示了 mSF 表面上的CaP 涂层。

为支持BP共轭，在31P-NMR光谱中进一步观察到磷峰位于18.27 ppm（图S4b ，支持信息）。

为了使 BP 基团与 Ca2 离子进行配位络合以及通过光聚合进行化

学交联反应，我们还制备了带有丙烯酰胺（Am）和 BP 基团的双官能化Am-HA-BP 衍生物。为此，首先通过酰胺化反应将丙烯酰胺和 2-二硫代吡啶基（SSPy）基团依次引入天然 HA（图3）

图 3.透明质酸（HA）基生物聚合物粘合剂的合成。使用碳二亚胺偶联和硫醇-二硫键交换反应，将双膦酸酯（BP）基团或 BP 和丙烯酰胺

（Am）基团化学键合至 HA 大分子的骨架。接头 1、2 和 3 用于 HA 修饰。

所得 Am-HA-SSPy 衍生物的 NMR 表征显示，除了单纯的 HA-SSPy 衍生物先前观察到的峰外，Am 基团的峰分别位于 5.7 和 6.2 ppm

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