双位点溶酶体靶向荧光探针分离检测活细胞内源性硫醇和SO₂外文翻译资料

 2022-08-07 10:52:21

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双位点溶酶体靶向荧光探针分离检测活细胞内源性硫醇和SO₂

生物硫醇和SO₂在许多生理和病理过程中起着至关重要的作用。为了揭示二者之间复杂的相互关系和细胞间的相互作用，开发能通过不同发射通道选择性检测生物硫醇和SO₂的单分子荧光探针是非常有必要的。本文在合理设计生物硫醇和SO₂双识别位点的基础上，设计了一种新的铬烯类衍生物BPO-Py-diNO₂，该化合物对生物硫醇和SO₂分别具有近红外荧光和绿色荧光的选择性和敏感性。两个通道的发射位移为170纳米。BPO-Py-diNO₂在溶酶体中选择性富集。它还可用于评价HeLa活细胞内内源性生物硫醇和SO₂的双通道成像，并可用于监测生物硫醇和SO₂的相互转化。

介绍

在生理和病理过程中，活性硫（RSS）如生物硫醇和SO₂是关键组分。生物硫醇包括半胱氨酸（Cys）、同型半胱氨酸（Hcy）和谷胱甘肽（GSH）是小巯基氨基酸，是rss2的必需分子，可调节氧化应激，控制信号传导，与金属离子螯合等。作为信号传导者，SO₂具有生物活性，特别是在调节心血管功能与NO和降低血压协同作用方面。异常的SO₂浓度与神经系统疾病、心血管疾病症状有关，尽管SO₂是通过生物合成途径由生物硫醇内生产生的，但是更好地理解它们之间的关系和细胞间的相互作用是非常有价值的。因此，建立方便的生物硫醇和SO₂检测方法是可取的。荧光探针对生物分子的无创成像具有很高的选择性和灵敏度，并且具有很高的实时时空分辨率，对于生物硫醇和SO₂，具有不同响应和不同发射通道的双识别位点的单分子荧光探针的研制一直是一个挑战。

最近，一种基于咔唑的双位点荧光探针被报道用于选择性检测活细胞中的生物醇和SO₂。Yin开发了第一种基于香豆素的双位点荧光探针，用于成像活细胞中Cys向SO₂的代谢。然而，这些探针的缺点是：（1）激发和发射波长短；（2）不同通道发射波长的位移有限，导致荧光成像中光谱重叠不明显。

溶酶体是一个重要的细胞器，负责大分子的降解和循环。RSS与溶酶体中的蛋白质分解密切相关。例如，GSH稳定溶酶体膜，Cys刺激肝溶酶体中的白蛋白降解。因此，荧光探针对生物体内的硫醇和SO₂作出反应为此，我们研制了一种以溶酶体为靶点的单分子荧光探针，用于检测具有较长发射波长和较大波长漂移的生物醇和二氧化硫。

结果与讨论

探头的合理设计与综合方案1描述了探头的设计策略。

铬烯基是一种荧光团，在生理条件下表现出较大的斯托克斯位移、大量的量子产率和光稳定性。它含有一个碳-碳双键，与氧原子相连，提供潜在的亲核性二氧化硫添加点。当共轭被破坏时，发射绿色荧光。同时，当铬烯的酚羟基被具有强吸电子基团的吡啶衍生物保护时，其荧光被猝灭。然而，保护基可被硫醇裂解以产生近红外荧光。因此，用硝基取代吡啶对铬烯进行修饰，合成了三种不同的探针BPO-Py-diNO ₂、BPO-Py-3-NO ₂和BPO-Py-5-NO ₂，以响应具有不同荧光信号的生物硫醇和SO₂。

目标分子的合成路线如图2所示。它需要四个步骤，如下所述。如前所述，合成了BPOH。17简单地说，3-（二乙氨基）苯酚与苯酐的Friedel-Crafts酰化反应生成化合物3，该化合物与环己酮经两步级联反应生成氧化铵5。对羟基苯甲醛与化合物5的缩合反应生成BPOH。通过BPOH与2-氯吡啶衍生物的亲核取代反应，得到了BPO-Py-diNO₂、BPO-Py-3-NO₂和BPO-Py-5-NO₂。用1H NMR、13C NMR和高分辨率质谱仪（见ESI）对探针进行了表征。

生物硫醇和SO₂的光学响应

在含有20%二甲基亚砜（DMSO）的10 mmol磷酸盐缓冲盐（PBS）溶液中，BPO-PydiNO₂在555 nm处出现最大吸收。与500mm亚硫酸盐反应后，吸收峰移向较短波长（图1a），495nm处的发射强度显著增加（图1b）。这证实了共轭体系被SO₂破坏。同时，在可见光下颜色从紫色变为淡黄色，在紫外线（UV）灯的365nm激发下绿色荧光增强（图1a）。在同一体系中，经500mm GSH处理后，BPO-Py-diNO₂的吸收峰由555nm移到566nm，吸收强度增加（图1a）。665nm处的发射强度也得到增强（图S1，ESI）。同时，溶液的颜色变为深紫色（图1a）。因此，BPO-Py-diNO₂可以通过两种不同的发射通道检测SO₂和生物硫醇，与其他报道的探针相比，在生物成像方面显示出两个优势：（1）生物硫醇的近红外检测和（2）流感病毒的170纳米位移

BPO-Py-3-NO₂和BPO-Py-5-NO₂与SO₂反应时，吸收和发射光谱变化相似，但与生物硫醇反应时没有变化（图S2和S3，ESItrade;）。如图S4和S5（ESI）所示，添加生物硫醇时几乎没有荧光变化。因此，BPO-Py-3-NO₂和BPO-Py-5-NO₂只能有效地检测。从它们的结构可以推断，生物硫醇必须有足够强的吸电子基团才能破坏醚键。

探针对SO₂的荧光响应

如图S6-S8（ESI）所示，当pH从4.0增加到10.0时，所有三个探针的495nm荧光强度变化不大。然而，当加入500mmNa₂SO₃时，当pH值从4.0增加到8.0时，BPO-Py-DiNO₂荧光强度增加。当pH值增加到10.0时，荧光强度略有下降。相反，BPO-Py-3-NO₂和BPO-Py-5-NO₂的荧光强度当pH值从4.0增加到7.0时，荧光强度增加；当pH值进一步增加到10.0时，荧光强度降低。因此，在以下实验中，BPO-Py-diNO₂的最佳pH值为8.0，而BPOPy-3-NO₂和BPO-Py-5-NO₂的最佳pH值为7.0。

如图2a和b所示，随着Na₂SO₃的加入，在495 nm处的发射强度逐渐增加。对于BPO-Py-diNO₂，添加600 mm Na₂SO₃导致强度增强因子为12.6，量子产率从0.003增加到0.130（表S1，ESIdagger;）。线性检测范围为20–200 mM（图2b），检测极限为150 nM。对于BPO-Py-3-NO₂，添加200 mM Na ₂SO ₃可将荧光强度提高47倍，检测极限为60 nM（图2）。S9和S10，ESIdagger;）

图2c和d显示，亚硫酸盐的存在导致了荧光光谱和强度的巨大变化。然而，活性氧物种（NaClO，H₂O₂，TBHP）和活性氮物种（NO₂﹣还有NO ₃﹣），其他活性硫物种（SO4 sup2;-，H ₂S、Cys、HCy和GSH）和氨基酸产生的变化可以忽略不计，但H2S引起的荧光强度略有增加。图3d显示了添加各种化合物前后在可见光和365nm光下的颜色变化。只有SO₂产生强烈的绿色荧光增强。BPO-Py-3-NO₂和BPO-Py-5-NO₂对与BPO-Py-diNO₂相关的SO₂表现出更好的选择性（图S11-S14，ESItrade;）。

BPO-Py-diNO₂对生物硫醇的荧光响应

在PBS/DMSO（8/2，v/v，pH 8.0）中，BPO-Py-diNO₂中加入GSH，在556nm激发下，产生了以665nm为中心的荧光发射。如图3a所示，665nm荧光强度随着GSH浓度在0-100 mM范围内增加。GSH的检测限为202nm（图3b）。活性氧（NaClO，H2O2，TBHP）和活性氮（NO₂）的BPO-Py-DiNO₂选择性还有3号），活性硫物种（SO42，S O 32在近红外波长范围内研究了H2S、Cys、HCy和GSH）以及氨基酸。只观察到生物硫醇的荧光增强（图3c），这导致了从紫色到深紫色的唯一颜色变化（图3d）。因此，BPO-Py-diNO₂在665nm处对生物硫醇具有良好的选择性。

传感机制

化合物5（方案2）具有与SO₂相互作用的探针的类似荧光光谱（图S15，ESItrade;），这表明其具有与反应产物类似的共轭结构。然后，在DMSO-d6/D2O（V/V=3:2）中加入Na₂SO₃到BPO-Py-5-NO₂的1hnmr实验表明，在8.31ppm时，原始的碳-碳双键作为一个单键向上移位到5.38ppm作为一个双键，这可以归因于SO32的加入连接到BPO-Py-5-NO₂的碳-碳双键（图S16，ESItrade;）。如前所述，光物理光谱的变化也证实了BPO-Py-diNO₂向BPOH的转化。18这些结果证实BPO-Py-diNO₂通过两个反应位点检测到了SO₂和生物硫醇。

活细胞的细胞毒性和荧光成像

用标准细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测不同浓度的HeLa细胞的细胞毒性（图4，图S17和S18，ESItrade;）。与其他两种探针相比，BPO-Py-diNO₂具有良好的生物相容性。在图4中，70%的细胞在10 mM BPO-Py-diNO₂中孵育24小时后存活。

共定位实验采用溶酶体靶向LyT或线粒体靶向MT绿色荧光染料进行对比。BPO-Py-diNO₂在红色通道（图5a）中的荧光图像与绿色通道中的LyT重叠良好（图5b，Pearson相关系数为0.91）。然而，在BPO-Py-diNO₂（图5f）和MT（图5g，Pearson的相关系数为0.66）之间观察到很差的重叠。这些结果表明BPO-Py-diNO₂能够特异性地靶向HeLa活细胞中的溶酶体。

为了检测活HeLa细胞（图6、图S19和图20，ESItrade;）中生物硫醇和SO₂的荧光成像，将细胞与BPO-Py-diNO₂孵育。30分钟后，绿色通道中没有荧光（图6a），但红色通道中有强荧光（图6b）。当HeLa细胞用N-乙基马来酰亚胺（NEM，一种细胞内巯基清除剂）预处理30分钟并进一步与BPO-PydiNO₂孵育时，观察到红色通道中的荧光显著减少（图6f），表明BPO-Py-diNO₂检测到细胞内的生物硫醇。同时，绿色通道（图6e）相对于图6a有荧光增强，这表明NEM消耗生物硫醇时产生内源性SO₂。此外，当用NEM预处理HeLa细胞30分钟，然后用BPO-Py-diNO₂和Na₂SO₃成功地进一步孵育时，在绿色通道（图6i）和红色通道（图6j）中都观察到荧光增强。这表明SO₂在活细胞中有可能转化为生物硫醇。结果表明，BPO-Py-diNO₂具有细胞膜通透性，可从两种不同的发射通道上成像内源性硫醇和SO₂。此外，BPO-pydiNO₂作为单分子荧光探针，可用于监测活体细胞中SO₂与生物硫醇的相互转化。

结论

综上所述，合成并评价了三种用于通过两个独立发射通道感测生物硫醇和SO₂的铬基探针。BPO-Py-3-NO₂和BPO-Py-5-NO₂仅对SO₂有较高的选择性和灵敏度，检测限低至66nm。相比之下，BPO-Py-diNO₂可以高选择性地从170 nm发射波长偏移分离的两个不同通道检测生物硫醇和SO₂。初步生物学实验表明，BPO-Py-diNO₂靶向溶酶体，可用于活体HeLa细胞内内源性生物醇和SO₂的成像。此外，它还可以用来监视生物醇与SO₂的相互转化，可以对这些生理过程提供更深入的了解。这一策略还可以更好地理解生物硫醇和二氧化硫的病理学方面。

实验

材料和通用仪器

除非另有说明，否则材料是从阿拉丁试剂和西格玛-奥尔德里奇中获得的，并且未经进一步纯化而使用。所有溶剂均按标准方法干燥，为高效液相色谱级或光谱级，用于光学光谱研究。在硅胶GF 254上进行薄层色谱（TLC）分析。在硅胶（HG/T2354-92）上进行柱层析纯化。用Bruker-AMX-400获得了核磁共振谱，其中1hnmr（400mhz）的化学位移以ppm为单位，相对于内参比四甲基硅烷。13cnmr（100mhz或125mhz）化学位移以cdcl3为内标。在Bruker-Daltonics生物飞行时间质谱仪上记录了高分辨率质谱数据。用日立F4600荧光光谱仪和10毫米石英比色杯获得荧光激发和发射光谱。在日立制药公司的UV-1900紫外可见分光光度计上记录了紫外可见吸收光谱。

探针的合成

向250 ml圆底烧瓶中添加16.5 g（100 mmol）3-二乙氨基苯酚、19.0 g（128 mmol）苯酐和70 ml甲苯。将混合物在氮气下加热至80 1C 10小时，90 1C 5小时，100 1C 2小时，然后110 1C 1小时。冷却至室温后，过滤所得沉淀物并用PhMe洗涤，得到28 g未经纯化的粗紫色固体化合物3（89.5%产率）。

将新鲜蒸馏的环己酮（6.6 ml，63.7 mmol）逐滴加入浓H2SO4（70 ml）中，冷却至0 1C，然后在剧烈搅拌下分批加入化合物3（32 mmol）。将反应混合物加热至901c并冷却1.5h，然后倒入冰（300g）。然后加入高氯酸（70%；7 ml），过滤所得沉淀物并用冷水（100 ml）洗涤。用二氯甲烷（DCM）硅胶柱层析纯化沉淀，得到DCM/甲醇（MeOH）（10/1，V/V）。得到9.4g的紫色固体化合物5（收率62%）。

将化合物5（1.72 g，3.60 mmol）和4-羟基苯甲醛（0.53 g，4.32 mmol）混合于40 ml AcOH中，在氮气下加热至90 1C过夜。然后在旋转蒸发器中减压除去溶剂。将粗品溶于50ml二氯甲烷中，用水（50ml）洗涤三次，用硫酸钠干燥。粗品经硅胶柱层析浓缩纯化，DCM-DCM/MeOH（10/1，V/V）得到1.35g深紫色固体BPOH（收率65%）。

约174.0 mg（0.3 mmol）BPOH溶于10 ml二甲基甲酰胺中。然后，添加3.0 mmol 2-二氯吡啶衍生物和207mg（1.5 mmol）K2CO3。在25–50 1C下反应3–5小时后，在旋转蒸发器中减压去除溶剂。粗品经硅胶柱层析、DCM-DCM-MeOH（20/1，V/V）纯化得到深紫色固

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