大行程变化的近红外开启荧光探针实时监测内源性半胱氨酸水平外文翻译资料

 2022-08-07 11:13:43

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题目：

大行程变化的近红外开启荧光探针实时监测内源性半胱氨酸水平

摘要：

半胱氨酸（Cys）作为一种重要的生物硫醇，在许多生理过程（例如蛋白质合成，排毒和代谢）中起着重要作用，并且与多种疾病密切相关； 因此，用于体内Cys检测的新型高选择性，灵敏的近红外（NIR）荧光探针的设计具有重要意义。 在本文中，我们报告了选择性和灵敏的NIR开启荧光探针（CP-NIR），具有大的斯托克斯位移，可用于体内检测Cys。 在探针溶液中加入Cys后，吸收波长从550 nm移至600 nm，同时以760 nm为中心的NIR荧光发射明显增强。 这种基于迈克尔加成反应的探针显示出较大的斯托克斯位移（160 nm），低检测限（48 nM），响应时间短和低毒性。 此外，这种具有良好细胞渗透性的新型近红外探针已成功应用于监测活细胞和小鼠模型中的内源性半胱氨酸。

正文：

近年来，半胱氨酸，高半胱氨酸，半胱氨酸，谷胱甘肽等含巯基的氨基酸引起了人们的广泛关注，这主要是因为它们在可逆的氧化还原稳态中的许多生理和病理过程中起着至关重要的作用，例如可逆的氧化还原稳态，组织的生长，和人体代谢。其中，半胱氨酸（Cys）是一种重要的生物硫醇，在蛋白质的合成，排毒和代谢中起作用，并且与许多疾病有关。例如，半胱氨酸（Cys）缺乏会导致造血功能降低，牛皮癣，神经毒性，水肿和肝损伤。相反，在心血管疾病和阿尔茨海默氏病中通常也表达过量的半胱氨酸。因此，开发一种灵敏且方便的检测两种活细胞中半胱氨酸的方法非常重要。以及在体内，以更好地阐明与这些疾病有关的病理学，并希望有助于相关的诊断和预后。
目前，基于特定的亲核加成和取代反应（例如迈克尔加成，醛环化，二硫键交换和裂解反应等），已经建立了许多基于小分子荧光探针的选择性检测Cys的探针，原因是它们的高尽管具有巨大的进步，但大多数基于荧光团的荧光探针在紫外或可见光范围内仍具有发射和吸收的能力，尽管这些技术取得了长足的进步，但这些成像技术不适合于成像由于短波长光激发的生物自发荧光产生强烈的干扰，紫外线对生物样品的有害作用以及组织中的强光散射，导致半胱氨酸在体内半衰期延长。为了有效克服这些问题，人们迫切需要具有组织深层穿透，组织光损伤小和自发荧光干扰小的优点的近红外（NIR; 650-900 nm）发射荧光探针。迄今为止，已经有几种用于Cys检测的NIR荧光探针被设计。然而，由于较小的斯托克斯位移，它们中的大多数具有“自我吸收”效果，这在某种程度上阻碍了它们在体内的使用。因此，对于体内应用而言，非常需要设计具有大斯托克斯位移的NIR荧光染料，该染料可以通过减少激发和发射带的重叠来大大提高灵敏度。

在这项研究中，我们设计并合成了具有大斯托克斯位移（160 nm）的Cys检测选择性NIR荧光探针（方案1中为CP-NIR）。该探针CP-NIR由二氰基亚甲基氧杂蒽结构和丙烯酸酯官能团组成（方案1）。丙烯酸酯基团作为淬灭和识别基团可以在Michael加成反应中与Cys选择性反应，Cys与丙烯酸酯基团之间的该反应生成相应的硫醚，随后分子内环化并进一步自消灭，生成内酰胺副产物和染料（CP -OH）具有很强的NIR荧光。 因此，可以通过独特的“开启”信号定量监控Cys的水平。 值得注意的是，该探针对Cys表现出高度敏感和选择性的NIR荧光“开启”响应。

方案1. CP-NIR用于Cys的荧光检测

此外，我们成功地将CP-NIR应用于活细胞中的Cys检测以及体内Cys成像。

实验部分：

材料和通用仪器：环己酮，2-羟基-4-甲氧基苯甲醛，PBr3，BBr3，K2CO3，CsCO3，MgSO4，Na2SO4，NaHCO3，氢化钙（CaH2），三乙胺（TEA）和N-乙基马来酰亚胺（NEM）购自阿拉丁试剂。 谷胱甘肽（GSH），半胱氨酸（Cys），高半胱氨酸（Hcy）和其他氨基酸购自Sigma-Aldrich。 Dulbeco改良的Eagle培养基（DMEM）和牛血清白蛋白（BSA）购自Life Technologies。分析级试剂二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺（DMF）用CaH2干燥，并在氮气氛下蒸馏。 氯仿，乙醇，乙酸乙酯，石油醚，甲醇和二甲基亚砜（DMSO）为分析纯，无需进一步纯化即可使用。 在整个实验中使用的水是三次蒸馏水。 使用硅胶（300-400目）进行柱色谱。 使用Sartorius PB-10数字pH计测量pH。

CP-OH和探针CP-NIR如支持信息的方案S1所述进行合成。探针和中间产物的结构已通过高分辨率质谱和质子核磁共振（1H NMR）证实。 1H NMR光谱在Bruker Avance 600 MHz NMR光谱仪上记录。高分辨率质谱在AB Sciex Triple TOF 5600 质谱仪上测定。 HPLC分析是在Agilent 1260高效液相色谱仪（含DAD）上进行

探针CP-NIR的合成：向CP-NIR（1当量）和Et3N（4当量）的10 mL无水CH2Cl2溶液中，在冰浴中滴加丙烯酰氯（4当量）。在0℃搅拌1 h后，将混合物将其加热至室温并搅拌16小时。将所得溶液用CH2Cl2（30mL）稀释，并用H2O（3times;15mL）洗涤，并用无水Na2SO4干燥。旋转蒸发除去溶剂。通过硅胶柱色谱法（CH2Cl2∶MeOH ＝ 50∶1）纯化，得到探针CP-NIR，为深蓝色固体。 1H NMR（500 MHz，CDCl3）delta;8.93（dd，J = 8.4，1.1 Hz，1H），8.10（d，J = 15.5 Hz，1H），7.73（ddd，J = 8.5，7.2，1.4 Hz，1H） ，7.62（dd，J = 8.4，1.0 Hz，1H），7.47minus;7.41（m，1H），7.13（d，J = 8.3 Hz，1H），7.01（t，J = 3.7Hz，1H），6.85（ dd，J = 8.3，2.2 Hz，1H），6.78（s，1H），6.68（dd，J = 17.3,1.1 Hz，1H），6.52（s，1H），6.37（dd，J = 17.3,10.5Hz） ，1H），6.19-6.07（m，2H），2.67-2.56（m，2H），2.51（t，J = 6.0Hz，2H），1.93-1.82（m，2H）; HR-MS（ESI）：C30H20N2O4 [M H] 的m / z计算值：473.1496；实测值：473.1496。发现473.1494。

光谱方法： 制备CP-NIR在DMSO中的储备液（1.0 mM），并用PBS缓冲液（10 mM，pH 7.4）稀释使用。Cys，GSH，Hcy和其他氨基酸（Ala，Glu，Arg，Ser，Lys，Asp，Gly，Leu，Ile，Gln，Tyr，His，Trp，Thr，Phe, Asn, Met, Val）储备液（5.0 mM）是在超纯水中制备的。在日立F-4600荧光分光光度计上记录荧光光谱，在日立U-3010紫外可见分光光度计上测量吸收光谱。 使用带有DP72彩色CCD的Olympus IX 71荧光显微镜获得荧光图像。

对于典型的光学测量，将CP-NIR溶液与一定量的分析物（Cys或其他）在DMSO：PBS缓冲溶液（1：1，v / v，总体积2 mL）中，在规定的pH下孵育。在37°C下（最终CP-NIR浓度为10mu;M）在1 cm光程下的石英比色皿进行测量。在指定的时间进行测量，获得了上述溶液的光谱。对于荧光测量，将激发波长设置为600nm，缝隙宽度为5times;10 nm。 为了进行竞争研究，将CP-NIR与每种竞争分析物（100mu;M）和Cys（100mu;M）孵育10分钟，并记录溶液在760 nm处的荧光强度。 同样，为了进行选择性研究，将CP-NIR与每种分析物分别孵育10分钟，并记录760 nm的荧光强度。

细胞培养和细胞成像。将HeLa细胞在37°C的培养箱（5％CO2气体）中的DMEM培养基（补充了10％胎牛血清； FBS，Invitrogen）中培养。然后，将细胞以每培养皿3times;105个细胞的密度接种在直径35毫米的玻璃底培养皿中，在Dulbecco最低必需培养基（DMEM）中放置24小时。添加CP-NIR（10mu;M），并在37°C下进一步孵育30分钟。用PBS洗涤两次以除去游离的探针CP-NIR分子后，将细胞在荧光显微镜下成像以检测内源性Cys。同时，进行了两个对照实验。在一个对照组中，首先在37°C下用N-乙基马来酰亚胺（NEM，1mM）预处理细胞30分钟，然后用PBS洗涤两次，然后将它们与CP-NIR（10mu;M）进一步孵育30分钟。在另一个对照组中，将细胞在37°C下用NEM（1 mM）预处理30分钟。之后，将它们分别与Cys（100mu;M）和CP-NIR（10mu;M）一起孵育30分钟。以相同的方式，对照组中的细胞在成像前用PBS洗涤两次以除去培养基。

动物实验和体内成像。为了进行体内成像，使用了BALB/c裸鼠（体重约20 g）。所有动物实验均在华南农业大学实验动物中心进行。所有动物实验均按照华南农业大学动物伦理委员会的规程进行。最初，在恒定的异氟烷气体下麻醉小鼠。首先，在裸鼠的右侧皮下注射CP-NIR（20mu;M，50mu;L），并在指定的时间后成像，以获得随时间的荧光反应。然后我们进行了另一个实验。我们将小鼠分为两组。一组在腹膜腔内腹膜内注射CP-NIR（20mu;M，100mu;L），并在10分钟后成像。作为对照组，另一组为腹膜内注射。注射NEM（盐水中1 m M）30分钟，然后腹腔注射。注射CP-NIR（20mu;M，100mu;L），并在10分钟后成像。全身成像是在荧光成像系统（Spectral Instruments Imaging AMI）下进行的，其激发滤光片为600 nm，发射滤光片为760 nm

结果和讨论

作为Cys的NIR荧光探针，CP-NIR包括一个基于二氰基亚甲基蒽吨基的荧光团和一个丙烯酸酯基作为Cys反应位点（识别部分）。丙烯酸酯官能团不仅具

有良好的荧光猝灭基团，而且还具有功能 由于在生理pH下Cys的亲核性较高，

因此它是Cys检测优于其他生物硫醇和氨基酸的良好识别位点。

CP-NIR是通过CP-OH（我们合成的一种新的荧光团，在NIR区域发射并具有较大的斯托克斯位移）与丙烯酰氯的迈克尔加成反应制备的（方案2）。

方案2.探针CP-NIR的合成

该探针的结构通过1 H NMR和MS分析确认。在支持信息中的图S1-S8中给出了详细的合成过程和结构表征。

带有或不带有Cys的CP-NIR的光谱特性。CP-NIR（10mu;M）时，在PBS缓冲液（10 mM，pH = 7.4，50％的DMSO，v / v）中，在有或没有Cys（100mu;M）的情况下研究其光谱特性。在37℃下。正如所料，游离探针CP-NIR在550 nm处显示主要吸收，而在760 nm处几乎没有荧光（图1和S9）。

图1.（a）在DMSO / PBS缓冲溶液（10 mM，pH 7.4，1：1v / v）中不加或不加半胱氨酸（100mu;M）的CP-NIR（10mu;M）的紫外可见光谱变化。（b）在DMSO / PBS缓冲溶液（10mM，pH 7.4，1：1 v / v）中不加或不加Cys（100mu;M）的CP-NIR（10mu;M）的荧光光谱变化。

将Cys添加到CP-NIR溶液中后，最大吸收增加，并轻微移至600 nm，可以观察到在760 nm处的NIR荧光显着增强（图1），表明CP-NIR可以作为开启光源探测其与半胱氨酸的反应。在760 nm处观察到荧光增强，在5分钟内达到平稳，表明CP-NIR对Cys的响应非常快（图2a）。相反，在没有Cys的情况下，CP-NIR溶液在30分钟内未显示任何明显的荧光变化（图2b）。

图2.（a）在37°C下在DMSO / PBS缓冲液（1：1，v / v，pH 7.4）中添加Cys（100mu;M）后，CP-NIR（10mu;M）的荧光光谱变化。（b）在DMSO / PBS缓冲液（1：1，v / v，pH 7.4）中不存在Cys，Hcy或GSH（100mu;M）的情况下，探针CP-NIR（10mu;M）在760 nm处随时间变化的发射强度变化，在600 nm激发。

此外，真正值得注意的是CP-OH的160 nm Stokes位移显着优势是另一个优势，因为如此大的Stokes位移将有助于有效监测活细胞和体内CP-OH的信号。

探针的选择性。为了证明该探针对Cys具有高选择性，然后我们通过添加细胞中广泛存在的各种其他分析物来研究CP-NIR对Cys的响应。首先，我们检查了探针CP-NIR对Cys的比对具有类似结构的其他生物硫醇（Hcy和GSH）的选择性。通过监测反应混合物中的荧光强度变化来确定随时间变化的荧光响应光谱。在加入10当量的Cys后，在600 nm处激发，在760 nm处的发射强度首先显示出快速增强

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