高通量肾上腺素试验，用于探索卤代醇脱卤酶在环氧化物开环反应中的催化潜力外文翻译资料

 2022-08-07 11:27:18

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高通量肾上腺素试验，用于探索卤代醇脱卤酶在环氧化物开环反应中的催化潜力

唐丽霞，刘余，姜荣祥，郑裕，郑楷，郑华宇

摘要：肾上腺素酶实验的原理是基于对高碘酸敏感的反应产物的定量与肾上腺素产生一种显色化合物。实验中可以通过测定细胞肾上腺素活性来实现卤代烃脱卤酶(HHDHs)的测定。本实验采用两种模型进行验证反应(甘油醛与亲核试剂和亚硝酸盐与环氧化合物)。气相色谱分析验证了该方法的可靠性。我们的研究结果表明，所建立的方法在两种文库筛选中都是有效的，并对其催化多样性和特异性进行了评价。因此，该方法是一种有价值的可应用于HHDHs工业应用的演变。此外,肾上腺素试验在酶学检测中显示出巨大的潜力，并可方便地用于其它合适的酶。

关键词：活性测定卤代醇脱卤酶beta;-取代醇

引言

定向进化代表了在工业化学合成中开发新型生物催化剂的主要选择之一。在每个定向进化实验中都需要进行适当的筛选测定。理想情况下，这样的酶测定应简单，稳健并且易于操作。肾上腺素测试是一种比色终点测定法，该测定法基于对高碘酸盐敏感反应产物的定量，方法是用L-肾上腺素反滴定剩余的高碘酸盐。

该方法可以从490 nm 处的吸光度变化判断肾上腺色素变化。原则上，该测定法适用于产生高碘酸盐敏感性产物的任何酶促反应，例如1,2 -二醇，1,2-氨基醇和alpha;-羟基酮。因此，肾上腺素测试显示出巨大的酶潜力。迄今为止，该测试已成功应用于脂肪酶，酯酶，环氧化物水解酶等几种酶的活性测量。

近年来，卤代醇脱卤酶由于其在亲核试剂介导的环氧化物开环反应中的催化混杂而产生了有价值的手性beta;-取代醇，因而备受关注。到现在为止，只有几个HHDHs基因被克隆和测序。基于序列比对，将酶分为三种类型（A，B和C）。这三种类型的酶具有不同的底物范围和对映选择性。在所有已知的HHDHS中，节杆菌属的HheA，农杆菌AD1中的AD2和HheC已得到最广泛的研究。在实践中，发现在大多数情况下，两种酶的环氧化物开环活性需要进一步提高以满足工业应用的特殊需求。HHDHs的酶活性通过气相色谱（GC）和高效液相色谱分析定量。但是，这些分析方法不适合以高通量方式评估HHDHS的环氧开环活性。

迄今为止，HHDHs可用的筛选测定都与酶的脱卤反应有关，因此，开发用于测定环氧化物开环反应中的酶活性的筛选测定法非常重要。在这项工作中，我们开发了一种简单而可靠的基于全细胞的肾上腺素测定法，用于测量由于酶促反应过程中1,2-二醇的释放而导致的HHDHs的环氧开环活性（图 1）。在以下两种情况下，HHDH催化的亲核环氧化物开环反应中生成1,2-二醇：（1）当将具有3-羟基的脂肪族1,2-环氧化物与任何高碘酸盐不敏感亲核体一起用作环氧化物底物时当亚硝酸盐用作亲核试剂时，HHDH可以接受（2）HHDH可以接受任何环氧化物（由于主要生成的不稳定的羟基亚硝酸酯中间体的水解）。该测定法既用于活性指纹图谱，又用于HHDHs的文库筛选。结果表明，开发的肾上腺素测定法是准确且可重复的。因此，该测定法可以代表HHDH和其他相关酶的进化的强大工具。

图1 ：肾上腺素测定法的原理，用于测试卤代醇脱卤酶（HHDHs）的活性

在途径A中，具有3 - 羟基的脂族1 ，2 - 环氧化物被用作环氧化物底物。 Nu表示HHDH 可以接受的任何高碘酸盐不敏感亲核试剂；在途径B中，Nu仅代表亚硝酸盐，而环氧化物是HHDH可以接受的任何取代的环氧乙烷。

材料和方法：

L-肾上腺素，1-阿拉伯糖，4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙烷磺酸（HEPES）和 1,2-环氧丁烷（a）购自Sigma（美国密苏里州圣路易斯）。1,2-环氧-3-甲基丁烷（b），3,3-二甲基-1,2-环氧丁烷（c），一氧化二丁烯（d），1,2-环氧己烷（e），1,2-环氧-7-辛烯（f）和1，2-环氧辛烷（g）购自Alfa Aesar（美国马萨诸塞州Ward Hill）。1,2-环氧-2-甲基丁烷（比利时，盖尔，阿克罗斯）（i）环氧己烯（美国密苏里州圣路易斯，奥尔德里奇）（j）缩水甘油（Aldrich）和2-环己基环氧乙烷（h）是来自Maja Majericacute; -Elenkov 博士（克罗地亚 RuđerBosˇ kovicacute;研 究所）的礼物。高碘酸钠，NaN₃，NaNO₂ 和其他化学品是分析级的本地产品。在20 mM HEPES 缓冲液（pH 7.5）中制备五十毫摩尔高碘酸钠和L-肾上腺素原液。将HCl 添加到L-肾上腺素溶液中以促进溶解。

蛋白表达

将携带靶基因的pBAD 载体（pBADHHDH）转化到感受态大肠杆菌 MC1061菌株中。为了以96孔微孔板形式表达目标蛋白，挑出带有所需重组质粒的菌落，并将其转移到96孔微孔板中，该板包含200mu;L补充100mu;g/ mL 氨苄青霉素和 0.002％（w / v）l-阿拉伯糖。在37℃下温育18 H（振荡速度：200 rpm） 后，通过在4℃（3,000g，10 分钟）下离心收集细胞，并用20 mM HEPES 缓冲液（pH 7.5）洗涤一次。将得到的细胞重悬于80mu;L 含有所需环氧化物（6.25 mM）的HEPES缓冲液中，并用于后续测定。在酶标仪（680 型，BioRad）上测量悬浮细胞的光密度（OD600），以计算蛋白质浓度，该浓度用作选择阳性变体的标准之一。

为了测量HheA和HheC的活性谱和底物特异性，在上述条件下以一些较小的修饰在500mL培养物中表达了两种野生型酶。在37℃下孵育达到OD600为 1.0，其中100mu;L然后将其用于接种含有100mu;g/ mL氨苄青霉素和0.02％1-阿拉伯糖（w / v）的500mL LB培养基。

在30℃诱导20H后，离心收集细胞并测量其湿重。随后将细胞以所需细胞浓度重悬于HEPES缓冲液（20mM，pH7.5）中。 为了准备用于GC分析的蛋白质，通过离心收集细胞并将其重悬于5 mL Tris–SO4缓冲液（200mM，pH7.5）中。粗提取物通过细胞超声处理，然后在4℃下离心（150,000g，60分钟）制备。使用Bradford方法测量蛋白质浓度。

基于全细胞的活性测定和文库筛选

用于HHDH活性测量的全细胞肾上腺素测定法和文库筛选是在96孔微板上的20mM HEPES 缓冲液（pH7.5）中于30℃下进行的。将20mu;L亲核试剂（终浓度为20mM）加入到80mu;L含有环氧化物（6.25mM）。温育1 H后，通过在4℃下离心（3,000 g，10分钟）结束反应。将一百微升上清液转移至新的96孔微孔板中，该孔板含有50mu;L具有所需浓度的NaIO4。 温育20分钟后，加入50mu;L 的L-肾上腺素，高碘酸盐和L-肾上腺素之间的浓度比为1：1。通过测量490nm 处红色染料腺色素的吸光度来监测酶促反应。不包含细胞或不包含底物的孔用作两个阴性对照。整个测定过程大约需要3H。

为了测量亚硝酸盐介导的环氧化物开环反应中HheA和HheC的活性指纹图谱，通过将200mu;L全细胞（OD600 = 2）添加到800mu;L含0.2％二甲亚砜的HEPES 缓冲液中来触发反应（v / v）以促进底物亚硝酸钠（25mM）和环氧化物（6.25mM）的增溶，但环氧化物g和j由于溶解度低而使用了2mM的最终浓度。在30℃下温育1H后，在4℃下离心终止反应。 然后转移100微升上清液，使其与50mu;L 高碘酸盐反应20分钟，然后进行肾上腺素滴定（最终浓度：2.0mM）

GC 分析

5 mM环氧化物与20mM每个亲核试剂的开环反应在5mLTris-SO4缓冲液（200mM，pH7.5）中于30℃进行，并通过添加1mLHHDH粗提物来触发反应具有所需的蛋白质浓度。 酶表达水平通过SDS-PAGE估计。所有酶促反应均通过在没有酶的情况下，在相同条件下进行反应。通过定期从反应混合物中取样（0.2mL）来监测转化率。样品用0.5mL含有1,3,5-三甲基苯的乙酸乙酯萃取。使用beta;-DEX225色谱柱（30mtimes;0.25mm，0.25mu;m）分析剩余的环氧化物。GC条件：80℃5分钟，10℃/ Min 至150℃。

3、结果和讨论

使用缩水甘油作为模型底物时分析的优化

由于在酶促反应过程中1,2-二醇的释放，肾上腺素测定可用于测量HHDHs 的环氧开环活性（图 1）。为了使测定更加准确，研究了导致改善全细胞形式测试特异性的因素。在整个测定开发过程中使用了20毫摩尔HEPES缓冲液（pH7.5）系统，因为它具有足够的缓冲酶促反应溶液的能力，并且对酶活性的测量没有任何干扰。考虑到超过1个当量。L-肾上腺素完全氧化为肾上腺色素需要高碘酸盐，试剂比固定为1：1。由于反应中使用的L-肾上腺素的量应足以反滴定剩余的高碘酸盐，这一点非常重要，因为反应中L-肾上腺素的过量非常重要。通过添加甘油来模仿二醇释放 （图 2）。

结果表明，通过目视检查，肾上腺色素的颜色随着甘油浓度的增加而逐渐降低，直至1.8mM（图 2，上图）。紫外可见测量表明，在所有测试的高碘酸盐浓度下，随着甘油浓度的增加，490nm处的吸光度呈线性下降，从而形成了三个平行线（图 2，下图）。结果表明，高碘酸盐浓度对检测甘油浓度变化的灵敏度没有显着影响。但是，测得的甘油浓度某种程度上取决于高碘酸盐的浓度。高碘酸盐的浓度越高，甘油的测量浓度就越高。

图2：使用肾上腺素测定法测量甘油

甘油（0–2.0mM）与高碘酸钠（1-3mM）分别在 96 孔微量滴定板（MTP）上的一式两份孔中反应20分钟，然后滴定 L-肾上腺素。（下图）在490nm 处的相应吸光度。该值是三个独立测量值的平均值。

为了确认该测定可用于HHDH变体的文库筛选，在缩水甘油与两种酶的反应中，进一步用两种野生型HHDH（HheA和HheC）和一种W139V的HheC变体验证了该测定。 亲核试剂N3minus;和NO2minus;（图 3）。W139V由于能够有效催化1,3-二氯-2-丙醇的脱卤反应。为了降低测定背景，在用高碘酸盐氧化1,2-二醇之前，通过离心将细胞从反应系统中移出。测定中使用的高碘酸盐浓度应根据在给定的酶促反应时间内形成的1,2-二醇的量进行调整。因此，使用不同浓度的高碘酸盐（0.5–4.0mM）进行上述三种酶活性谱的检测（支持信息中的 图 S1）。在研究中使用的实验条件下，在1.5和2.0mM的高碘酸盐（图 3）存在下，三种酶之间的颜色密度差异可以清晰地观察到。而对于其他浓度的高碘酸盐，则很难分析酶活性的差异（支持信息中的图 S1）。

在三种测试酶催化的缩水甘油的叠氮化物介导的环氧开环反应中，两种野生型HHDH的肾上腺色素颜色密度彼此相当，但低于HheC-W139V mu-通过目视检查和在490nm处的吸光度测量，发现HheA = HheC的活性谱gt;W139V（图3A）。尽管HheC的活动模式gt; W139Vgt; HheA 是通过缩水甘油与NO2minus;的环氧开环反应获得的（图 3B）。

图3: 在亲核试剂介导的缩水甘油开环反应中，三个测试的HHDH的活性谱

酶促反应在20mM HEPES 缓冲液（ pH7.5 ）中进行。控制1：HEPES含有细胞的缓冲液（20mM，pH7.5）;对照2 ：含有相应亲核试剂和缩水甘油的HEPES缓冲液（20mM，pH7.5）。（A）将叠氮化物（20mM）用作亲核试剂。（B）亚硝酸盐（20mM）用作亲核试剂。颜色密度与酶活性有关。颜色密度越弱，酶活性越高。490nm处的相应吸光度描绘为条形图的高度，并显示在下面的面板中。黑色柱状图表示在1.5mM高碘酸盐存在下获得的值；灰色柱状图表示在2.0mM高碘酸盐存在下获得的值。该值是三个独立测量值的平均值。

该测定法具有可重复性，并且这三种酶的活性谱与亲核试剂的类型相关。与 1,3-二氯-2-丙醇的脱卤化反应相比，缩水甘油的环氧开环反应中的三种酶的活性谱差异显着（W139Vgt; HheCgt; HheA）。显然，脱卤活性测定不适用于环氧化物开环反应中HHDH的活性测定。因此，在这项研究中开发了肾上腺素测定法。

通过 GC 分析评估分析

气相色谱分析也证实了测定三种被测酶活性的测定方法的可靠性。为此，使用三种酶的粗提物进行了叠氮化物和亚硝酸盐介导的缩水甘油开环反应（图 4）。通过SDS-PAGE分析了三种测试酶在96孔微孔板和20 mL培养皿中的表达水平（图 5）。尽管HheA的表达水平远低于两种HheC酶的表达水平，但是这三种酶在20mL刻度上的表达模式与96孔微孔板相似。因此，使用发达的肾上腺素测定法和GC方法测得的酶活性结果应具有可比性。在叠氮化物介导的缩水甘油的开环反应中（图4A），HheA和HheC的转化率均高于W139V突变体的转化率。2.5 H后，HheA，HheC和W139V的反应分别达到总转化率的83％，90％和48％。对于亚硝酸盐介导的缩水甘油的开环反应（图4B），HheC在三种酶中表现出最高的活性，给出的活性顺序为HheCgt; W139Vgt; HheA。2 H后，HheA，HheC和W139V的反应转化率分别达到34％，93％和68％。显然，这三种酶的两种活性模式与通过肾上腺素测定获得的相似。结果进一步证实，肾上腺素测定是可靠的，并且可以用于测量亲核试剂介导的缩水甘油开环反应中HHDHs的活性。

图4: 亲核试剂介导的环氧开环反应中缩水甘油消耗的GC分析

在

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