转铁蛋白稳定紫杉醇纳米晶配方的开发与评价外文翻译资料

 2022-08-08 11:59:24

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转铁蛋白稳定紫杉醇纳米晶配方的开发与评价

引言

紫杉醇是从太平洋红豆杉(Taxusbrevifolia)[1]树皮中提取的一种天然二萜类化合物。 在临床试验中， 紫杉醇通过与微管的高亲和力结合，稳定和增强微管蛋白聚合和抑制纺锤体微管动力学， 表现出抗肿瘤活性[2– 4]。这些活性有效地抑制细胞有丝分裂、 运动和细胞内转运， 导致凋亡细胞死亡。不幸的是，紫杉醇天然形式的临床进展受到其物理化学性质的限制， 更具体地说，它的水溶性差(~0.3mu; g/ml)[5]。 紫杉醇分子结构中缺少一个官能团， 使得天然分子的化学修饰增加溶解度难以[6]。 因此， 选择合适的递送平台来递送紫杉醇对于这种抗肿瘤化合物的临床进展尤为关键。研究了各种紫杉醇给药系统， 以提高紫杉醇的溶解度和药理性质， 包括胶束、 脂质体、 微粒、 纳米粒子和共溶剂和环糊精的使用[7– 10]。 最广为人知的输送平台是一种共溶剂系统， 由50： 50的CremophorEL混合物组成reg;（ 聚氧乙基蓖麻油） 和乙醇。 相应的配方(紫杉醇reg; 或一般等价物)由紫杉醇组成， 溶解在上述助溶剂系统中， 浓度为6mg/ml， 用生理盐水或5%葡萄糖溶液[11]稀释后静脉注射。 虽然这种方法克服了紫杉醇的极限溶解度， 但使用CremophorEL与严重和剂量限制的毒性有关。 更具体地说， CremophorEL已知从标准静脉油管中浸出增塑剂，释放二（ 2-乙基己基） 邻苯二甲酸(DEHP)[1]。 在I期临床试验[12]， 20-40%的未复药患者中， DEHP的输注已被证明能产生组胺释放并导致过敏反应。 此外， 银耳还与高脂血症、 红细胞聚集、 感觉神经病变和中性粒细胞减少有关[13– 15]. 显然， 有必要开发紫杉醇的替代输送系统， 以提高药物的溶解度， 同时消除不良反应。紫杉醇可能的替代输送系统是一种纳米悬浮制剂。 纳米悬浮剂由纳米颗粒组成， 这些颗粒可能是或可能不是由合适的稳定剂或多个稳定剂稳定的[16,17]。 几种药物的纳米悬浮制剂已经上市， 包括Rapamunereg;（西罗莫司） ， Emendreg; （预备） 和特里科reg;（非诺贝特） [18]。 使用纳米悬浮制剂有几个优点紫杉醇等抗癌药物的递送： （一） 纳米颗粒可以提高Noyes-Whitney和Ostwald-Freundlich原理预测的难溶药物的溶解速度和饱和溶解度， 这通常会导致生物利用度[19]的增加； （二)纳米颗粒不需要增溶化化学物质， 因此有可能实现高的载药量[20](三） 纳米颗粒可能通过增强渗透和抗肿瘤效果而获得更好的效果， 这与肿瘤[21]附近颗粒的外渗和滞留有关。 鉴于这些优势， 人们越来越有兴趣将抗癌药物制成纳米悬浮制剂。生产纳米晶体颗粒的技术可分为自上而下的技术， 如铣削和高压均匀化， 以及自下而上的方法， 如沉淀和自组装[22– 26]. 常用的自顶向下方法有局限性， 如需要重复铣削周期， 以及铣削材料侵蚀的潜在污染。 特别是高压均质化需要相对较高的循环次数来实现足够的粒度降低， 这增加了污染和产品降解的成本和风险。 沉淀法包括将药物溶解在溶剂中， 然后将其添加到非溶剂中， 从而产生精细分散的沉淀药物。 与自顶向下技术相比， 沉淀法的一个主要优点是相对简单， 成本低。 然而， 由于溶剂是在这一过程中使用的， 溶剂的选择和去除是需要考虑的重要问题。 此外， 纳米晶的尺寸可能很难控制。 纳米晶的稳定性是一个主要关注的问题； 粒子聚集和生长可以发生， 并且应该[27]防止。为了稳定纳米晶配方， 典型的策略包括在纳米悬浮液中加入亲水性聚合物和/或表面活性剂。 稳定是通过空间位阻或静电阻碍来实现的， 这些聚合物或表面活性剂吸附在纳米晶表面和/或改变液体环境的介电常数。 常用的稳定剂包括半合成非离子聚合物如羟丙基甲基纤维素(HPMC)， 合成线性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和聚乙二醇(PEG400)， 合成共聚物如Pluronicreg;f127 还有 f68， 离子表面活性剂 例如 作为 钠 十二烷基硫酸盐(SDS)和非离子表面活性剂例如聚山梨酯吐温reg;20和reg;之间80 [28].另一种可能的策略是使用蛋白质作为稳定剂。 特别是， 在体内自然发现的蛋白质， 如血清蛋白， 是传统稳定剂的一种有吸引力的替代品。 蛋白质在过去被广泛用作乳化剂， 有助于稳定水中油乳剂的[29]。 理论上， 血清蛋白， 如白蛋白， 也可能对纳米晶提供稳定作用， 因为已知它们吸附在疏水表面上具有一定程度的结合亲和力，因此可能对纳米晶的聚集和生长提供空间位阻[30,31]. 在初步研究中， 发现在药物纳米悬浮剂中存在血清， 与纳米悬浮剂中没有血清相比， 在随后的离心和干燥过程中有效地抑制了颗粒尺寸的增加（数据未显示） 。 血清的存在也被发现抑制纳米晶在水缓冲环境中的聚集。 因此， 血清蛋白可能是稳定纳米悬浮的候选蛋白。 除了稳定作用外， 使用血清蛋白比传统聚合物或表面活性剂为基础的稳定剂的潜在优势是能够结合某些膜蛋白， 这些膜蛋白通常存在于肿瘤细胞[32]中。 结合存在于肿瘤细胞膜中的受体蛋白的能力是一种在抗肿瘤治疗中特别有价值的特性， 因为它可能有助于将抗癌药物靶向到肿瘤部位[33]。本研究描述了以血清蛋白为稳定剂的紫杉醇纳米悬浮制剂的开发和评价。 成功地将血清蛋白分馏成不同的组分分析了最大稳定效果。 然后进一步分析了最有效组分的主要成分(由SDS-PAGE确定)作为紫杉醇纳米悬浮液配方的潜在稳定剂。 据作者所知， 本文描述的配方是一种新的方法来开发基于纳米粒子的抗肿瘤治疗， 因为血清蛋白被用作非共价的稳定剂。 用人KB鼻咽癌细胞和SKOV-3卵巢癌细胞模型评价该制剂的体外抗肿瘤效果。 将从KB细胞获得的数据与小鼠模型的数据进行比较，以评估紫杉醇纳米悬浮制剂的体内性能。

材料和方法

紫杉醇纳米晶体制备

紫杉醇(PTX)由SamyangGenex公司（韩国大田)提供） 。 纳米晶体的制备采用抗溶剂沉淀法， 辅以超声处理。 简单地说， 在快速搅拌（ 1200转/分） 和强烈超声作用(FS20D浴声纳器， Fisher科学，Waltham， MA)下， 在4° C下， 将1毫升PTX溶液注入带有或不含聚合物或表面活性剂的去离子水中)。 评价的溶剂为甲醇、 乙醇、 亚甲基氯化物(DCM)、 乙酸乙酯(EA)和二甲基亚砜(DMSO)(SigmaAldrich，St 。 路 易 斯 ， 莫 ) 。 聚 合 物 和 表 面 活 性 剂 来 自HPMC(HerculesInc.， Wilmington， DE)、 PVP(陶氏化学公司， 米德兰， MI)、 PEG400(SigmaAldrich， 圣路易斯， MO)、 Pluronic F127和F68（ 巴斯夫， 弗洛勒姆公园， 新泽西州） 、 SDS(SigmaAldrich，圣路易斯， MO)、 吐温20和吐温80(SigmaAldrich， St。 路易斯，莫)。 对加工条件（溶剂-溶剂比、 搅拌速度、 混合时间） 进行了评价， 以评价其在加工20min内产生小于300nm的稳定纳米颗粒的能力。图中给出了最终工艺参数优化的详细流程图。

制剂配制

血清蛋白质分馏

人血清(AB型， 男性， SigmaAldrich， 圣路易斯， MO)按照改良的冷乙醇血浆-蛋白质沉淀过程被分离成几个组分[34,35]。 总之， 制备了三种原液： 4M醋酸钠缓冲液、 10M醋酸和53.3%(v/v)乙醇-水混合物。 通过仔细控制处理缓冲液环境的离子强度、 pH和极性， 得到每一组分的血清蛋白。 缓冲液的离子强度、 pH和极性受上述三种原液
组成的不同控制。 每个馏分在3500times; g下离心10min， 从其余部分中分离出来。 用所描述的程序分离血清蛋白在图中。 将1分共4分， 冷冻干燥。 馏分储存在-20° C直到进一步使用。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

用标准建立的SDS-PAGE对血清蛋白组分进行了表征。 制备了由10%堆积和5%溶解凝胶组成的聚丙烯酰胺凝胶。 电泳后， 用考马斯蓝染色， 然后用甲醇和冰醋酸染色。 用标准分子量标记蛋白(BioRad， Hercules， CA)电泳测定蛋白质条带的分子量)。

制定方案

PTX纳米晶是根据本手稿中概述的程序制备的。 将一定量的PTX纳米晶悬浮在去离子水中， 加入血清蛋白组分1-4、 血清蛋白人血清白蛋白(HSA)、 转铁蛋白(Trf)或免疫球蛋白G(IgG)(Sigma-Aldrich， 圣路易斯，在温和的搅拌下， 以滴状的方式。 当加入PT X纳米悬浮液完成后， 混合物继续轻轻搅拌15分钟， 然后在4° C离心和冷冻干燥。 对制剂组成(PTX与血清分数或血清蛋白比值)进行了评价， 以评价其在冷冻干燥后产生稳定的纳米悬浮液的能力， 其粒径变化最小。 此外， 最终目标制剂应具有至少25%载药量的组成。

配方的表征

粒度和zeta电位分析

用动态光散射(90Plus颗粒尺寸分析仪， 布鲁克海文仪器， 霍茨维尔， 纽约)测量平均粒径和多分散性指数(PDI)。 用配备Zeta电位分析仪的同一仪器测量Zeta电位(ZP。 对于样品的制备， 大约1毫克的冷冻干燥样品悬浮在4毫升的再蒸馏水中， 涡旋5分钟， 然后超声作用30秒，将样品分散在整个培养基中。 选择合适的散射强度进行最终测量。 测定粒度， PDI和ZP一式三份。

粒子形态

用扫描电子显微镜(SEM)(FEINova)对颗粒形貌进行了表征tm 纳米扫描电镜， 费伊， 希尔斯堡， 或) 还有 原子的力显微镜(AFM)(生物镜催化剂reg;布鲁克尔仪器公司， MA)。 在真空条件下， 将少量冻干样品小心地沉积在铝存根表面， 用导电层铂溅射涂层1min， 制备了SEM表征样品。

物理状态表征

用粉末X射线衍射(PXRD)(西门子BrukerD5000， BrukerAXS)对纯PTX和配方的固体形态进行了表征，麦迪逊， WI)使用CuK辐射在30米A和45k V(扫描速率0.4° /min)， 衍射角（2theta; ） 为3-40° 。 在加入样品保持架之前， 用研钵和杵粉碎所需数量的纯或冻干纳米悬浮液， 制备PXRD样品。 多余的粉末样品被刮走，粉末样品的表面用玻璃玻片整平。

储存稳定性研究

在3个月的时间内， PTX配方保存在4° C。 在0、 1、 2和3个月测定了贮藏样品的粒径、 PDI和ZP。 此外， 用PX RD对在4° C下储存3个月的样品进行了固体形态表征，以进行物理稳定性评估。

药物含量

通过准确测定5mg冻干纳米悬浮液， 并通过涡旋和超声作用在1ml去离子水中重新悬浮， 测定制剂中PTX的含量。 然后在悬浮液中加入大约10毫升的冷乙醇， 并通过涡旋和超声作用大力混合20分钟。 在5000转/分钟离心5分钟后， 收集含有溶解PTX的上清液。 用冷乙醇洗涤含有沉淀蛋白的颗粒。 离心和洗涤程序重复至少3次， 每次收集上清液并合并。 将PTX溶液旋转蒸发， 再溶于10ml流动相中， 用HPLC进行分析。高效液相色谱系统(Agilent1100系列， Agilent， 圣克拉拉， CA)配备了自动进样器、 在线除气器和紫外吸收检测器。 分离是用一个现象C-18（ 250毫米times; 4.6毫米） 分析柱(Torrance， CA)， 流速为1ml/min， 检测波长为228注入体积为20mu; l。 流动相包括水、 乙腈和甲醇(40： 30：30v/v)。 样品和流动相分别在使用前通过0.22mu; m注射器过滤器和0.48mu; m膜过滤器过滤，。

体外溶出度

通过在磷酸盐缓冲盐水(PBS， pH7.4)中悬浮准确测量的冷冻干燥PTX配 方 ， 并 将 悬 浮 液 转 移 到 透 析 膜 盒 中 (Slide-A-LyzerG2 ，ThermoScience， Rockford， IL)， 分子量截止3500Da。 将含有PT X纳米悬浮液的盒式磁带浸入PBS缓冲液中， 在37plusmn;1° C的培养箱中， 在恒定的摇动（100转/分)下） 。 水槽条件保持： 溶解药物的最大理论浓度为饱和浓度的b1。 在预定的时间间隔内， 从膜盒外部提取样品， 用HPLC进行分析。 取出的体积用新鲜缓冲液代替。 在分析药物浓度之前， 样品通过低蛋白结合的0.2mu; m醋酸纤维过滤器过滤。 按上述方法对样品进行HPLC分析。 实验一式三份。

制剂的体外细胞毒性

细胞培养

从DR中获得人KB表皮癌细胞和SKOV-3卵巢癌细胞。 尹耀的实验室（ 普渡大学） 。 细胞培养基FA缺乏的RPMI-1640， 添加10%胎牛血清， 100U/ml青霉素和100mu; g/ml链霉素和Dulbecco改良鹰培养基(DMEM)， 添加10%(v/v)热灭活胎牛血清(FBS)， 从纽约大岛生命技术有限公司获得。 用FA缺乏的RPMI-1640在37° C湿化气氛中培养人KB表皮癌细胞2 和90%的相对湿度(Nuaire孵化器， 普利茅斯， MN)。 细胞传代后达到约90% 汇合点从 T型瓶使用 0.25% 胰蛋白酶-EDTA(西格玛 奥德里奇， 圣路易斯， MO)。 在含有5%CO的加湿气氛下， 在37° C的DMEM中培养SKOV-3卵巢癌细胞。

细胞毒性研究

这种方法与先前报道的体外细胞毒性研究相媲美。 在密度为5times; 10的96孔板中接种KB细胞4 细胞/嗯。 在密度为4times; 10的96孔板中播种SKOV-3细胞5 细胞/嗯。 将PTX制剂悬浮于缓冲液中， 浓度为10mg/ml， 进一步稀释， 从10mg/ml稀释至1times; 10-8 用于测量的毫克/毫升。 转铁蛋白溶液也在相同浓度值的缓冲液中稀释。 然后将细胞暴露在37° C的悬浮液或溶液中72小时。 用PBS洗涤一次去除样品后， 在每口井中加入20mu;

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