用于一氧化氮协同光动力消除生物膜的表面电荷可切换超分子纳米载体外文翻译资料

 2022-08-08 12:02:07

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用于一氧化氮协同光动力消除生物膜的表面电荷可切换超分子纳米载体

Dengfeng Hu, Yongyan Deng, Fan Jia, Qiao Jin, and Jian Ji

MOE Key Laboratory of Macromolecule Synthesis and Functionalization of Ministry of Education, Department of Polymer Science and Engineering, Zhejiang University, Hangzhou 310027, China

摘 要

生物膜已导致许多顽固性的临床感染疾病，对公共健康构成了严重威胁。迫切需要开发出根除生物膜的抗菌策略。在本文中，我们开发了一种表面电荷可切换的超分子纳米载体，该载体表现出对酸性生物膜的pH响应渗透性，用于一氧化氮（NO）协同光动力消灭耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（MRSA）生物膜，而在激光照射下对健康组织的损害可忽略不计。最初，通过整合谷胱甘肽（GSH）敏感的alpha;-环糊精（alpha;-CD）共轭氧化氮（NO）前药（alpha;-CD-NO）和二氢卟酚e6（Ce6）前药（alpha;-CD-Ce6），在宿主与客体的相互作用下，氧化成对pH敏感的聚（乙二醇）（PEG）嵌段多肽共聚物（PEG-（KLAKLAK）2-DA），精细制备超分子纳米载体alpha;-CD-Ce6-NO-DA。超分子纳米载体显示出完全的表面电荷反转，从生理pH值（7.4）的负电荷变为酸性生物膜pH值（5.5）的正电荷，促进高效渗透到生物膜中。纳米载体一旦渗入生物膜，就会因生物膜中过表达的谷胱甘肽触发NO的迅速释放，这不仅会产生大量NO来杀死细菌，而且会降低生物膜GSH的水平，从而提高光动力疗法（PDT）的效率。另一方面，NO可以与活性氧（ROS）反应生成活性氮（RNS），从而进一步提高PDT效率。由于纳米载体有效渗透到生物膜中并耗尽了生物膜中的GSH，表面电荷可转换的GSH敏感型NO纳米载体可以在低光敏剂剂量和低激光强度的情况下极大地提高PDT效率，并且对健康组织的副作用可忽略不计。考虑到上述优点，在这项工作中开发的策略可能为抵抗生物膜感染提供很大的可能性。

关键词：生物膜 一氧化氮 消除谷胱甘肽 光动力疗法 协同作用

  1. 引言

由致病菌引起的感染已成为重要的死亡原因，每年全世界约有70万人死亡，并且超过60%的人类感染疾病都归因于生物膜，例如慢性细菌性前列腺炎，慢性中耳炎和骨髓炎[1]-[3]。生物膜中的细菌将自身包裹在一种细胞外聚合物（EPS）的屏蔽基质中，该基质主要由蛋白质，细菌DNA，胞外多糖和酶组成[4][5]。EPS基质不仅可以充当保护屏障，保护细菌群免受宿主固有免疫细胞侵害，同时也防止了抗菌剂。由于EPS的封装，生物膜微环境缺少氧气，导致厌氧糖酵解[6]。因此，酸性和高度还原性环境通常存在于许多生物膜中[7]-[10]。例如，耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（MRSA）生物膜微环境的pH可以达到5.5甚至更低，大肠杆菌生物膜中还原性谷胱甘肽（GSH）的浓度高达10 mM[3][7][8][11]。利用生物膜的特定微环境，制定对抗生物膜感染的新策略，尤其是针对多重耐药菌引起的生物膜感染[12][13]。

为解决严重的生物膜感染，采取了许多策略[14]-[16]，不仅包括采用化学疗法抗生素，季铵化合物[17][18]，阳离子聚合物[19][20]，和抗生物膜水凝胶[21][22]或涂层[23][24]，也涉及非化学疗法，例如光动力疗法（PDT）[25][26]和光热疗法（PTT）[27]，已经被提出和研究。作为一种发展中的策略，PDT具有许多优势，例如最小的入侵和裸露的耐药性，在生物膜治疗中引起了越来越多的关注。在PDT期间，光敏剂在具有适应性波长的光照射下与周围的氧反应，产生具有破坏细菌细胞膜和DNA并诱导细菌细胞凋亡或坏死的巨大潜力的活性氧（ROS）[28][29]。尽管已经做了很多努力，但是，由于光敏剂向生物膜的渗透率低以及高水平生物膜谷胱甘肽（GSH）大量消耗了ROS，通常会大大降低PDT对生物膜感染的效率，这仍然是一个巨大的挑战[30]。因此，为了有效地杀死生物膜，PDT必须使用非常大的光敏剂剂量和很高的激光强度，这会严重损害健康组织并给患者带来很多痛苦。赋予光敏剂高生物膜渗透能力和出色的生物膜GSH消耗能力，仍然是PDT生物膜感染的巨大挑战和必要条件。据我们所知，尚无使用GSH清除剂作为协同剂协同消除生物膜的光动力的报道。

一氧化氮（NO）是一种独特的生物活性分子，在许多生理和病理生理过程中，例如伤口愈合和对病原菌的免疫反应起着重要的作用[31][32]。NO可以作为一种杀菌剂引起人们的关注，该杀菌剂能够通过脂质过氧化，DNA裂解和蛋白质功能异常来杀死细菌[33][34]。更有趣的是，在生命的代谢过程中，NO可以作为促进GSH消耗的有效分子[30]。此外，NO可以与PDT产生的ROS发生反应，生成活性氮物种（RNS），例如过氧亚硝酸盐阴离子（ONOO-）[35]。RNS可以通过产生自由基过氧化作用来加重对细菌的总破坏，而自由基过氧化作用比ROS表现出更强的杀菌活性[30]。另外，据报道带正电的纳米载体可以有效地渗透到生物膜中[36]-[39]。然而，带正电的纳米载体通常表现出较差的循环能力。为了解决这种冲突，以生物膜的酸性微环境为目标的电荷可转换纳米载体可能是生物膜感染治疗的有效策略。

在当前的工作中，使用多功能NO供体设计了针对生物膜微环境的协同抗生物膜系统，以提高PDT的功效。超分子alpha;-CD-Ce6-NO-DA纳米载体通过基于alpha;-CD的前药（alpha;-CD-NO和alpha;-CD-Ce6）与pH敏感共聚物PEG-（KLAKLAK）2-DA（方案1a）之间的主客体相互作用来制备的。alpha;-CD-Ce6-NO-DA纳米载体在生理pH值为7.4时带负电，这有利于其在血液中长期循环。在酸性生物膜pH 5.5下，alpha;-CD-Ce6-NO-DA纳米载体表现出完全的电荷反转并带正电，从而有助于其有效渗透到生物膜中并粘附于带负电的细菌表面。渗透到生物膜中后，alpha;-CD-Ce6-NO-DA纳米载体可以释放由GSH触发的NO，这可以通过等式（1）中的级联反应显着降低生物膜中GSH的浓度（方案1b）。GSH诱导的GSH消耗可以被认为是抑制PDT中GSH消耗ROS的良好策略，这对提高PDT效率非常有利。此外，基于等式（2）（方案1b），释放GSH的NO分子可与光触发的ROS反应生成具有更强杀菌力的RNS（ONOO-）（方案1b），从而进一步提高了PDT的效率。 因此，表面电荷可切换的超分子alpha;-CD-Ce6-NO-DA纳米载体可以表现出出色的NO协同光动力消除MRSA生物膜。

方案1.（a）alpha;-CD-Ce6-NO-DA纳米载体的制备过程示意图；（b）在pH 5.5下PEG-（KLAKLAK）2-DA的酸活化电荷反转的示意图；（c）通过alpha;-CD-Ce6-NO-DA纳米载体产生的ROS和NO之间的协同作用，消除MRSA生物膜相关感染的机制示意图。

  1. 结果和讨论
  2. alpha;-CD-Ce6-NODA纳米载体的制备与表征

通过将Ce6和NO供体分别与alpha;-环糊精（alpha;-CD）[40]，结合制备alpha;-CD-Ce6和alpha;-CD-NO（方案S1a，b）。通过1 H NMR证实，每个alpha;-CD分子都具有一个由三亚乙基四胺间隔子束缚的Ce6基或一个SNAP基（图S1）。通过酰胺化反应，用2,3-二甲基马来酸酐（DA）[41]修饰制备的PEG嵌段多肽共聚物PEG-（KLAKLAK）2，获得具有pH敏感的电荷逆转能力的PEG-（KLAKLAK）2-DA（方案S1c）。除非使用琥珀酸酐（SA），否则也通过相同的方法合成不具有pH敏感的电荷反转能力的PEG-（KLAKLAK）2 -SA（方案S1d）。通过alpha;-CD前药（alpha;-CD-Ce6和alpha;-CD-NO）与PEG-（KLAKLAK）2-DA[42][43]之间的主客体相互作用，制备了分子动力学尺寸为136.3plusmn;2.1 nm的超分子alpha;-CD-Ce6-NO-DA纳米载体。制备的alpha;-CD-Ce6-NO-DA纳米载体为具有规则且轮廓分明的球形结构，通过透射电子显微镜（TEM）进行检测（图1a）。带负电的（KLAKLAK）2-DA电晕可用作保护性防污壳，可延长pH 7.4时在体内的循环时间。根据UV-vis光谱以及Ce6和NO标准曲线，计算得出纳米载体中Ce6和NO的负载量分别为1.9%和3.6%（图S2）。同时，用相同的方法制备了alpha;-CD-Ce6-NO-SA纳米载体（由alpha;-CD-Ce6和alpha;-CD-NO前药以及PEG-（KLAKLAK）2 -SA制备）（Dh=135.2plusmn;2.5 nm）作为对照（图1b）。带负电荷的alpha;-CD-Ce6-NO-DA和alpha;-CD-Ce6-NO-SA在pH 7.4下显示出优异的结构稳定性，在磷酸盐缓冲盐水（PBS）缓冲液中存储7天后尺寸变化可忽略不计（图1d ）。与在酸性生物膜pH 5.5下仍具有带负电表面的alpha;-CD-Ce6-NO-SA不同，由于酸引发的裂解，alpha;-CD-Ce6-NO-DA纳米载体在pH 5.5上显示带正电的表面。氨基和DA之间形成的酰胺键（图1c和方案S1e）具有更大的潜力，可以更好地渗透到生物膜中。实际上，这种表面电荷逆转的机理是2,3-二甲基马来酸酐的酰胺键在酸性环境（pH 5.5）下很容易水解，这是由于羧基的强拉电子效应[44][45]。然而，在pH 7.4时，键非常稳定。因此，具有2，3-二甲基马来酸酐（DA）作为壳的纳米载体在循环期间（pH 7.4）带负电，但在pH 5.5下带正电。此外，alpha;-CD-Ce6-DA纳米载体（由alpha;-CD-Ce6前药和PEG-（KLAKLAK）2-DA制成，Dh=142.1plusmn;3.1 nm），alpha;-CD-NO-DA纳米载体（由alpha;-CD-NO前药和PEG-（KLAKLAK）2-DA制成，Dh=128.4plusmn;1.4 nm），alpha;-CD-Ce6-SA纳米载体（由alpha;-CD-Ce6前药和PEG-（KLAKLAK）2-SA制成，Dh=141.5plusmn;2.3 nm）和alpha;-CD-NO-SA纳米载体（由alpha;-CD-NO前药和PEG-（KLAKLAK）2-SA制成，Dh=125.2plusmn;2.2 nm）也准备作为对照（图S3）。alpha;-CD-Ce6-DA和alpha;-CD-NO-DA纳米载体均显示出从pH 7.4到pH 5.5的明显的pH敏感电荷反转。相反，alpha;-CD-Ce6-SA和alpha;-CD-NO-SA纳米载体在pH 7.4和pH 5.5处带负电（图S4）。

图1.（a）alpha;-CD-Ce6-NO-DA和（b）alpha;-CD-Ce6-NO-SA的流体动力学直径（Dh）和TEM图像（比例尺：400 nm）；（c）分别在pH 5.5和pH 7.4下的alpha;-CD-Ce6-NO-DA和alpha;-CD-Ce6-NO-SA的zeta;电位。（d）在储存7天期间，PBS缓冲液（10 mM，pH 7.4）中alpha;-CD-Ce6-NO-DA和alpha;-CD-Ce6-NO-SA的流体力学尺寸。

  1. alpha;-CD-Ce6-NO-DA纳米载体对生物膜的渗透

alpha;-CD-Ce6-NO-DA纳米载体渗透到生物膜中是杀死细菌的前提。因此，通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）研究纳米载体的渗透性。将MRSA生物膜与alpha;-CD-Ce6-NO-DA纳米载体温育一个小时后，在生物膜中甚至在生物膜的底部观察到大量Ce6的红色荧光，表明alpha;-CD-Ce6-NO-DA纳米载体有效渗透进入MRSA生物膜。而在与alpha;-CD-Ce6-NO-SA纳米载体孵育的生物膜中，仅在生物膜的表面层上检测到非常微弱的Ce6红色荧光，表明alpha;-CD-Ce6-NO-SA纳米载体对MRSA生物膜（图2）的渗透性非常弱。alpha;-CD-Ce6-NO-DA纳米载体与alpha;-CD-Ce6-NO-SA纳米载体之间的渗透性不同，可能是由于生物膜在酸性微环境中的表面电荷不同。在生理pH 7.4时，alpha;-CD-Ce6-NO-DA纳米载体和alpha;-CD-Ce6-NO- SA纳米载体均带负电，有利于在血液中长期循环。在酸性生物膜pH 5.5下，羧基转化为氨基后，alpha;-CD-Ce6-NO-DA纳米载体的表面带正电，这促使纳米载体渗入生物膜并粘附到细菌细胞带负电的表面。但是，由于alpha;-CD-Ce6-NO-SA纳米载体在pH 5.5时仍带负电荷，因此严重阻止了它们渗入生物膜中（图1c和图S4）。

图2.（a）分别与PBS，alpha;-CD-Ce6-NO-SA和alpha;-CD-Ce6-NO-DA孵育一小时后，MRSA生物膜的CLSM图像。（绿色荧光：SYTO 9染色的MRSA生物膜；红色荧光：alpha;-CD-Ce6-NO-SA或alpha;-CD-Ce6-NO-DA中的Ce6）。比例尺：100 mu;m； （b）（a）中SYTO 9荧光强度百分比的半定量统计；（c）（a）中生物膜中Ce6荧光强度百分比的半定量统计。

  1. GSH触发alpha;-CD-Ce6-NO-DA释放NO

为了研究由GSH触发的alpha;-CD-Ce6-NO-DA纳米载体的NO释放行为，将超分子纳米载体与各种GSH浓度一起孵育，并记录NO的释放曲线。如图3

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