溶胶-凝胶硅胶玻璃封装的圆柱假丝酵母脂肪酶催化r-氯酯的对映选择性氨解外文翻译资料

 2022-08-08 12:05:53

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溶胶-凝胶硅胶玻璃封装的圆柱假丝酵母脂肪酶催化r-氯酯的对映选择性氨解

摘要：用溶胶-凝胶法从圆柱假丝酵母(CcL)中制备脂肪酶，用多孔二氧化硅玻璃包裹，催化2-氯丙酸乙酯的对映选择性氨解。二氧化硅基质能提高酶的活性，即提高产量。考察了氨解反应的范围和局限性，实现了酯的动态动力学拆分。被封装的脂肪酶在重复使用时仍保持活性。包封大大提高了脂肪酶的手性识别能力，使脂肪酶在有机化学中的应用更加广泛。

在室温下，用溶胶-凝胶法，即合适的醇盐缩合聚合法制备二氧化硅及其各种有机衍生物的玻璃。温和的反应条件允许酶、催化抗体和其他蛋白质包埋在这些玻璃中。由此产生的生物复合材料具有作为传感器和多相催化剂的巨大前景，但要实现这一前景，需要研究蛋白质和周围玻璃基质之间的相互作用。这项研究才刚刚开始，3关于基质对被包裹生物分子的活性和稳定性的各种影响还有很多需要了解。

脂肪酶，从各种生物体中获得，是当今有机化学家所能得到的最有用的酶。它们催化许多底物的酯化、酯交换、酰胺化、转酰胺化和水解。由于脂肪酶的这种巨大用途，其在溶胶-凝胶玻璃中的封装研究比其他任何酶都多。Reetz及其同事的研究表明，酶的活性和稳定性可以通过改变基质的疏水性来调整，甚至提高。5a将酶制成多相催化剂在合成实践中非常有优势，封装的脂肪酶可以购买。

脂肪酶作为有机化学催化剂的主要优点是其对映体选择性强，这在溶胶-凝胶玻璃中很少被研究。这是我们信的主题。柱状念珠菌脂肪酶催化酯对映选择性氨解。我们比较了该酶在反应混合物中悬浮和在反应混合物中悬浮的溶胶-凝胶硅粉中包裹时的效果。我们对包埋酶的稳定性、催化活性、氨解反应的对映选择性以及催化剂的可回收性等方面感兴趣。我们的结果表明包被酶比游离酶有相当大的优势。

本研究目的：我们考察了硅基质对包封圆柱菊脂肪酶的稳定性和对映选择性的影响。我们最近对除脂肪酶以外的催化剂的研究表明，二氧化硅基质可能通过间接增强“背景”反应来降低亚砜化反应的对映选择性，而“背景”反应并不是对映选择性的。显然，在硅基体中反应的对映选择性不能被认为是理所当然的。

对映选择性反应的选择：悬浮在有机溶剂中的粗圆柱花脂肪酶(CcL)催化各种胺类外消旋酯的反应，如式1所示。收率和对映选择性一般较好。我们利用这个已知的反应来研究有机改性溶胶-凝胶硅玻璃对酶稳定性、反应收率和对映选择性的可能影响。对于外消旋酯的动力学拆分，应该使用2:1的酯与胺的比例。理想情况下，酯反应较快的对映体将被转化为酰胺的单一对映体，而酯反应较慢的对映体将保留。当酯胺比大于2:1时，胺是限制剂;当这一比例低于2:1时，酯的快速反应对映体是限制试剂。

脂肪酶的封装：酶封装到疏水溶胶-凝胶玻璃中。从采购的粗酶中提取酶的水溶性部分(命名为wsCcL)。采用溶胶凝胶法测定三甲氧基丙基硅烷与四甲氧基硅烷的摩尔比为9A 5:1。实验过程可以在辅助资料中找到。

对苯甲醚在60°C下对映选择性氨解2-氯丙酸乙酯：24 h后，在CcL水溶性组分存在下进行氨解反应(见表1，条目1)，产率较低，但对映选择性较好。几天后，产率有所增加，但对映选择性几乎消失(条目2和3)。包被的CcL(指定CcL@glass)比自由酶产出更多的酰胺，且具有良好的对映选择性。条目4和条目1表明，包膜脂肪酶在一定条件下比游离脂肪酶反应性更强，但反应约24 h后停止。

表1 60℃柱状锥花脂肪酶催化对茴香胺对氯丙酸乙酯对映选择性氨解

条目

1

2

3

4

5

6

7

8

催化剂

wsCcLa

CcL@glassb

CcL@glassb

酯：胺

2:1

2:1

5:1

1:1

1:2

2:1

时间（h）

24

48

217

24

30

24

25

26

产率（%）

1.3

6.0

21

64

54

62

116c

4

ee(%)

85

6.0

2.0

94

96

86

71c

74

条目4-7显示了反应物比例的影响。降低酯胺比(条目6和7)可以提高收率，但降低了对映选择性。收率大于100%，同时对映选择性下降（条目7)，表明当胺大量存在时，酯的反应较慢的对映体也发生反应。因为在我们的其他实验中胺的含量从来没有超标，所以这种异常现象被避免了。

为了测试催化剂的可回收性，从反应混合物中反复回收催化剂，用CCl4和丙酮清洗，然后重复使用。如图1所示，在60℃条件下，经过3个24h循环后，收率下降到个位数，对映选择性下降。

图1 循环利用溶胶-凝胶硅胶玻璃封装的圆柱菊脂肪酶对酰胺(上)和(S)-对映体(下)产率的影响。实验时间为24 h，外消旋酯与胺的比例为2:1。温度为60 (●)和25(▲)°C。

时间

胺收率%

酯收率%

将被包裹的酶在70℃CCl4中加热14天后过滤掉，用水彻底提取有机相。Bradford测试显示提取物中没有蛋白质。考虑到本试验的灵敏度，最多有0.10-0.20%的被包裹的酶可能从二氧化硅中泄漏出来。在加入反应物之前(条目8)，将包封的酶在60°C条件下保持24 h，其产率和对映选择性均低于新催化剂(条目4)。这些实验表明，如图1所示，封装的脂肪酶性能下降是由于酶在60℃下的热失活，而不是由于酶从玻璃基质中泄漏。

25°C对苯甲醚对映选择性氨解2-氯丙酸乙酯：水溶性(表2，条目1-3)和封装形式(表2，条目4-6)的脂肪酶在25℃时比60℃时产率更高，对映体选择性也更高(表1，条目1-3和4)。此外，在25℃下，包被酶是一种比游离酶更有效的催化剂(表2，条目4-6 v s 1-3)。在加入反应物前，将包封的脂肪酶在25℃条件下放置48 h(表2，条目7-9)，产率有所下降，但对映选择性仍然很高。

如图1所示，被包裹的酶在25℃下多次循环后仍保持相当的效率。事实上，25℃条件下10个周期的相对产量下降幅度仍然小于60℃条件下2个周期的相对产量下降幅度。此外，在25°C循环10次后，对映选择性仍然很高。这种良好的室温性能使封装的脂肪酶成为一种方便的合成催化剂。

表2 25℃柱状锥花脂肪酶催化对茴香胺对氯丙酸乙酯对映选择性氨解

条目

1

2

3

4

5

6

7

8

9

催化剂

wsCcLa

CcL@glassb

CcL@glassb

时间（h）

24

48

310

24

48

197

24

44

235

收益率（%）

7

16

31

81

89

100

58

67

79

ee(%)

94

87

83

94

94

88

98

94

93

其他胺对2-氯丙酸乙酯的对映选择性氨解：我们还研究了其他几种胺在氨解反应中的作用。结果如表3所示。对甲苯胺(条目1-2)和苄胺(条目3-4)在25℃时均比60℃时产生更多的酰胺，具有更好的对映选择性。这些结果与更高温度下酶的热失活是一致的，我们也发现了对茴香胺(见上文)。在25°C和5°C时，挥发性较高的脂肪胺(条目5-12)的结果几乎相同。

相应的酰胺对对甲苯胺、苄胺、正丁胺、环己胺均有较好的对映选择性。相应的酰胺对对甲苯胺、苄胺、正丁胺、环己胺均有较好的对映选择性。

表3 圆柱菊脂肪酶催化胺类rnh2对映选择性氨解2-氯丙酸乙酯

条目

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

R

p-tolyl

PhCH2

allyl

n-Bu

Cy

t-Bu

温 度（°C）

60

25

60

25

25

5

25

5

25

5

25

5

时间（h）

24

127

24

170

4

12

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