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生物资源技术杂志
奥尼氏希瓦氏菌在乳酸纯培养物和葡萄糖培养物中与乳酸乳球菌以电极作为电子受体的共培养物
Miriam A. Rosenbaum Haim Y. Bar Qasim K. Beg Daniel Segregrave; James Booth Michael A. Cotta Largus T. Angenent
伊萨卡康奈尔大学生物与环境工程系、生物统计和计算生物学系，美国纽约州
波士顿大学生物医学工程系、生物学系和生物信息学，美国马萨诸塞州波士顿
生物能源研究股，美国农业部，农业研究服务（ARS），国家农业利用研究中心（NCAUR），美国伊利诺伊州皮奥里亚
通讯作者：电话： 1 607 255 2480 传真： 1 607 255 4449
电子邮件： la249@cornell.edu
摘 要
利用混合微生物群落作为生物催化剂的生物电化学系统(BES)正在获得进展作为可再生能源、生物修复和生物传感设备的可能性。当我们开始了解单个微生物物种如何与作为电子供体的电极相互作用时，很少知道群落中不同微生物之间是否有相互作用。糖发酵细菌可以以一种中性的、积极的方式与当前产生的微生物相互作用提升或产生消极影响。在这里，我们比较了希瓦氏菌在纯培养和同乳酸发酵剂乳酸乳球菌共培养中生物电化学的性能和与常规BES操作相关的条件下，希瓦氏菌只能使用乳酸盐作为电流产生的电子供体，而共培养可以将葡萄糖转化为电流可比库仑效率17%。通过(电)化学分析和转录谱分析，结果表明，BES的性能与奥奈达希瓦氏菌纯培养和共同培养的生理无显著差异。因此，微生物在纯粹的基质(中性)中一起工作。这些共培养实验是理解微生物在BES群落中相互作用的重要一步，目的是设计复杂的微生物群落将目标基板转化为电能。
关键词：生物电化学系统、微生物燃料电池、希瓦氏菌、微阵列、乳酸
1.导论
与固体末端电子受体(如矿物氧化物或电极)一起呼吸的能力，使希瓦氏菌MR-1成为微生物燃料电池(MFC)或更普遍的生物电化学系统(BES)研究的模型生物(Bretschger等，2007;Gorby等人，2006;Kim等人，1999,2002;Marsili等人，2008年;Nealson等人，2002年)。在BESs的阳极室中，微生物将有机底物分解产生的电子转移到阳极(即固体电子受体的厌氧呼吸)。这种电子转移在废水处理、生物修复和生物传感等领域有着广阔的应用前景。所有已知的微生物胞外呼吸机制都被认为是由希瓦氏菌所采用的:(i)通过外膜氧化还原蛋白直接电子转移(Kim et al.， 1999;Myers and Myers, 2001)，可能借助于导电性附件(Gorby et al.2006);(ii)通过微生物产生的可溶性氧化还原化合物的介导电子转移(Marsili等，2008;von Canstein等人，2008年)。除希瓦氏菌外，直接传递电子的硫还原地杆菌(Geobacter sulfurreducens)和介质(phenazine)产生者铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是研究生物电化学系统中胞外电子传递功能的重要模式生物(通常被称为阳极呼吸细菌[ARB])。
希瓦氏菌与固体电子受体进行厌氧呼吸时，典型的电子供体是乳酸盐，它被氧化成乙酸盐、二氧化碳和四个电子。最近的研究表明，氧可以促进希瓦氏菌来利用更广泛的碳源，产生电流(如醋酸盐)(Biffinger et al.，2008;Ringeisen等人，2007;Rosenbaum等人，2010年)。然而，这种通用性的提高发生在从基底到电极的电子转移效率较低的情况下(即库仑效率)。因为希瓦氏菌被发现于未定义混合培养MFC的厌氧群落(Kim et al.，2006)，虽然乳酸不是常见的主要MFC底物，但我们认为，在BES阳极室厌氧食物网中，希瓦氏菌在发酵过程和电极呼吸之间发挥重要的终端连接作用。为了提高生物群落将特定有机基质转化为电能的效率，我们需要了解微生物在混合培养皿，阳极食物网中的相互作用。在生物电化学系统中，只有很少的研究在确定的共培养菌中研究微生物的相互作用。Ren等(2007) 用直接电子转移菌的硫还原性G. sulfurreducens研究了纤维素酵解纤维素梭状芽胞杆菌以纤维素为底物产生电流，共培养的电化学性能与纯培养的硫还原性G.在乙酸盐的作用下表现相似。Read等(2010)研究了生物膜的形成和电化学性能。联合两种革兰氏 发酵剂:丙酮丁酸梭菌和粪肠球菌。他们发现，所有测试的与粪便粪肠球菌共培养物的电流产量都增加了，而与丙酮丁醇梭菌共培养物产生的电流比革兰氏纯培养要少。因此，发酵剂和ARB之间的相互作用可能是多种多样的:中性的-只有食物链关系(硫还原菌G.和纤维素分解菌C.);阳性-增强共培养的当前产量(所有检测的ARBs和粪肠球菌);和阴性-与纯ARB相比，共培养(所有测试的ARB和丙酮丁醇梭菌)的当前产量减少。在这个时候，预测发酵罐和ARB之间的相互作用类型是不可能的。
在这里，我们研究了在与不可代谢的底物(如葡萄糖)共培养的情况下，如何影响希瓦氏菌的生理机能。我们将希瓦氏菌MR-1与同乳酸发酵剂乳球菌(Lactococcus lactis)在连续流动的BES中结合。乳酸乳球菌将C-6糖发酵成l -乳酸，因此，这两种生物的结合应该可以使希瓦氏菌以葡萄糖为主要燃料产生电流。除了研究纯和共培养生物膜的电化学行为外，我们还进行了化学、生化和显微镜分析，在电化学实验结束时，我们从纯和共培养生物膜中回收了mRNA。用Affymetrix基因芯片对其进行转录分析。这一分析使我们能够确定在葡萄糖的协同共培养中，希瓦氏菌MR-1是否会发生生理变化。
2. 方法
2.1.生物电化学系统的菌株和介质
希瓦氏菌MR-1(来自波士顿大学Tim Gardner，在LB培养基中培养，以维持菌株。乳酸乳球菌 LM 0230 (Efstathiou and McKay, 1977) 来自美国农业研究所生物能源研究单位，美国农业部，皮奥里亚，IL. 乳酸乳球菌在M17乳酸菌培养基(DSMZ medium449)和5 g/L灭菌过滤后的葡萄糖。生物电化学实验中确定的阳极介质根据Myers、Nealson(1988)和was修改添加1.27 mM K2HPO4, 0.73 mM KH2PO4, 125 mM NaCl, 5 mM HEPES, 0.5 g/L酵母提取物，0.5 g/L色氨酸，和5 g/L b-甘油磷酸钠-培养基要求为L.乳酸(不添加氨基酸)。高压灭菌后，加入1 g/L无菌葡萄糖、20 mM L-乳酸钠和20 mM K2HPO4。分析化学物为ACS级。
2.2.反应堆设置
两个相同的h型电化学反应器由玻璃制成，阳极和阴极液室，体积各为220毫升(补充图S1)。阳极和阴极室使用阴离子交换膜(19.6 cm2, AMI-7001 Membranes International, Glen Rock, NJ, USA)隔开。每个阳极室温度控制在30℃水套,搅拌,不断用定义介质的水力停留时间(HRT) 5 - 10 h,并用配有碳纸电极(50 cm2geometric表面积,AvCarb P50,燃料电池店,圣地亚哥,美国),作为工作电极。它与碳水泥(CCC carbon Adhesive, EMS, Hatfield, PA, USA)绑定在石墨棒(Poco石墨公司，Decatur, TX, USA)上。我们使用一个Ag/AgCl(饱和KCl)参比电极来控制工作电极(阳极)电位。阴极室(对电极室)用石墨块电极(3times;9times;1厘米，poco石墨，Decatur，德克萨斯州，美国)。包括两个10升加料罐在内的整个装配装置，在实验前进行了高压灭菌。这些槽是连续使用的，其中一个槽在龙胆纯培养阶段同时给两个阳极室供电。在任何时候，中罐和反应器都保持在20%CO2和80%N2的正压力下无氧。
2.3.电化学测量
用乳酸作为电子供体，在两种平行反应器的设置下，在0.4 V恒电位(所有电位参考标准氢电极，SHE)工作电极上，稳态希瓦氏菌生物膜生长。在接种希瓦氏菌培养前，在生长培养基中进行空白电化学测量。在一些试验中，乳酸乳杆菌生长所需的复杂培养基成分(酵母提取物，色氨酸，b-甘油磷酸酯)被添加到越来越多的希瓦氏菌纯培养中，以评估这些成分的生物电化学效果(我们核实后,这些媒体组件没有效果,他们从一开始就被添加到介质)。一旦获得了稳定的生物电化学性能，一个反应器被切换到没有L-乳酸的培养基槽(从现在起叫反应器SL，与反应器S相反，反应器S仍然被注入20mm乳酸)，同时向两个反应器中加入1g /L的葡萄糖。当剩余乳酸被清除后，将隔夜生长的L.乳酸接种到反应器SL中。循环伏安法测试(0.3 ~ 0.7 V, V = 1 mV/s)。这个实验系列重复了几次，性能相似，但操作时间长短不同。从其中两个试验中，收集了生物膜RNA进行转录分析。在每次实验结束时，用反应器液电镀确认培养物的纯度(希瓦氏菌形成典型的粉红色菌落)。
2.4.化学分析
每隔一天采集阳极出水样品，以测定HRT、出水pH、l -乳酸(Accutrend乳酸分析仪，罗氏诊断)和其他可溶性代谢物。过滤样品(0.2 lm硝基纤维素过滤器，Millipore, Billerica, MA, USA) ，使用配备了示差折光检测器(热费希尔科学Inc .)和一个有机酸柱（Aminex HPX-87H Column, Bio-Rad2624 M.A. Rosenbaum et al. / Bioresource Technology 102 (2011) 2623–2628 Laboratories Inc, Hercules, CA, USA）的液相色谱系统，来分析对糖、有机酸和乙醇。样品在65℃下，用5 mM硫酸以0.6 mL/min洗脱。
2.5.扫描电镜成像
实验结束时，取部分碳纸电极进行扫描电镜成像:电极样品用2.5%戊二醛和1%四氧化锇固定，然后进行系列乙醇脱水，临界点干燥，薄金涂层。照片是用日立S-450扫描电子显微镜在20千伏加速电压下拍摄的。
2.6. 微阵列分析
2.6.1. 用于微阵列的化学试剂
用于分子生物学工作的通用化学品都被认证为无核糖核酸酶。Qiagen公司(巴伦西亚，CA)提供了RNA保护试剂和DNA纯化试剂盒。在RNA分离/纯化和希瓦氏菌芯片杂交(Affymetrix Inc.， Santa Clara, CA)的各个步骤中使用的其他特定试剂和化学品是从几个不同的供应商购买的:上标逆转录酶II，DTT，随机六聚体，和来自Invitrogen Inc. (Carlsbad, CA)的BSA; Affymetrix公司的基因芯片标记试剂、全缓冲液和B2oligo;DNAse来自Pierce Biochemicals Inc. (Rockford, IL);MES库存，溶菌酶，山羊IgG, 200度乙醇Sigma-Aldrich(圣路易斯，MO);终端转移酶、鲱鱼精子DNA和dNTPs (Promega Inc.);来自载体实验室的生物素的抗链霉亲和素抗体(Burlingame, CA)SSPE，链霉亲和素，SAPE, 10% Tween 20, NaOH, HCl from Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA);和RNA se-free DNA se I RNA纯化酶，TE缓冲液(pH 8.0)，Superase 1n, 5 M NaCl，和无核酸酶水来自Ambion(Austin, TX)
2.6.2. RNA采样和分离
用于微阵列分析的RNA取自两个S和两个SL生物电化学反应器。将碳纸电极从反应器中取出，在Qiagen RNA-protect中浸泡30秒，然后立即在80℃下冷冻。用无菌刀片刮取电极主干上的生物膜样本，使其松动，但不去除。然后用2ml RNA protect清洗电极主干，将生物膜碳污泥转移到15 mL的试管中。加入7毫升冰冷磷酸盐缓冲盐水(PBS)，以最高速度涡旋，5500g离心10分钟。沥出上清液，用7ml冰冻PBS替换。然后，混合物在7 W的情况下在冰上进行30秒的声波处理。旋涡、离心和声波重复两次。然后，用0.75 mL NAES缓冲液(50 mM醋酸钠缓冲液，10 mM EDTA, 1% SDS, pH为5)重悬。RNA用苯酚:氯仿提取法分离，类似于Cury和Koo(2007)。根据制造商的说明，用Ambion DNase I处理从基因组DNA污染中纯化分离出的RNA。用NanoDrop光谱仪(Thermo Scientific, Wilmington, DE)对RNA产量进行定量，并计算紫外光谱(UV)的260/280比率，以检查每个RNA样本的纯度。RNA质量在1.5%琼脂糖电泳凝胶与溴化乙腈染色。
2.6.3. 微阵列杂交
先前描述的协议(Driscoll, 2008;Faith等人，2007)用于Affymetrix公司的希瓦氏菌芯片的微阵列。总而言之，每个RNA样本约10lg用于反转录、cDNA纯化和cDNA片段化合成cDNA。随后进行cDNA标记，并在45℃时在希瓦氏菌阵列上杂交16 h。根据Affymetrix原核阵列方案，使用Affymetrix洗涤缓冲液A和B、Goat IgG、链霉亲和素、抗链霉亲和素和SAPE对标记的阵列进行多次洗涤和染色。随后，用Affymetrix基因芯片扫描仪3000对染色阵列进行扫描。希瓦氏菌MF-1芯片数据已提交到Gene Expression Omnibus(登录号GSE20343)。
2.6.4. 统计分析
微阵列数据使用lemma(拉普拉斯近似电磁微阵列分析)软件包进行分析，Bar和Schifano
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