甲醛降解菌的分离及降解特性的评价外文翻译资料

 2022-08-08 20:39:09

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甲醛降解菌的分离及降解特性的评价

摘要

在实验室中分离到一株甲醛降解菌B1。然后从形态、生理、生化等方面对菌株B1进行了鉴定，鉴定为假单胞菌。随后，在生物滤池中对甲醛的生物降解特性进行了评价。当进口负荷低于38.9 毫克/升/小时时甲醛去除率保持在90%以上。此外，当反应器在中断30天后重新启动时，菌株B1迅速成为优势菌，说明该菌株具有适应性和弹性。数值模拟结果表明，该模型较好地拟合了含B1菌株生物滤池的最大降解速率。菌株B1的生物滤池降解率与霍尔丹模型吻合较好。

关键词:

恶臭假单胞菌 甲醛 生物过滤 降解动力学 霍尔丹模型

引言

甲醛被广泛用作溶剂或原料，用于生产各种建筑材料，如化纤地毯、塑料地砖、油漆等涂料。然而，甲醛是一种致癌物质，它会导致严重的健康问题。此外，甲醛能与蛋白质以及非特异性核酸发生反应;甲醛与DNA反应可以合成甲醛交联加合物，从而破坏细胞，导致微生物死亡。

随着经济的发展和人民生活水平的提高，中国建筑业的发展呈现出前所未有的繁荣景象。随之而来的是建筑室内装饰材料中的化学物质对人体健康产生严重危害的有关问题。某些建筑材料如脲醛树脂和酚醛树脂是室内甲醛的主要来源。建筑材料释放的甲醛已成为室内主要污染物之一，并经常与病态建筑综合症联系在一起，对人类的健康产生了巨大的潜在威胁。

随着人们对于职业健康和安全意识的提高，在工作场所和居住环境中清除甲醛已变得越来越重要。科学家们研究了消除甲醛的各种方法，例如物理吸附法，化学法，生物技术等。物理吸附法例如活性炭等多孔材料的物理吸附性能优异，但甲醛只能从一个地方转移到另一个地方，无法消除。甲而醛的化学氧化是高效的，但化学反应产生的副产物会造成二次污染。其他的植物过滤、光催化降解等方法效率低、成本高，难以推广应用。然而，生物技术被认为是最合适的选择之一，因为它有潜力用低浓度的挥发性有机化合物(VOCs)处理大体积的污染物。此外，与物理吸附和化学氧化相比，微生物降解技术更环保、更经济。

Fulazzaky等人指出,在细菌过滤器中甲醛的去除出现了两个连续的阶段:(1)甲醛从气相扩散到水相形成甲酸和甲醇,(2)主要微生物能够吸收代谢从水相中的甲醛产生的化学物质，用来促进生长，维持自身的新陈代谢。在这两个过程中，包装材料的性质、pH值和微生物多样性等因素对生物过滤系统的性能起着至关重要的作用。在相关因素中，微生物作为降解引擎在生物过滤系统中被认为是主要因素。然而，由于甲醛的抗菌特性，微生物在高甲醛浓度下产生了明显的抑制现象。因此，筛选出对甲醛具有高耐受性的微生物是目前甲醛生物降解领域的优先研究目标。

近藤等人从天然土壤中分离出一种抗甲醛真菌，并将其命名为nomius IRI013曲霉菌。研究表明，从真菌中提取的甲酸氧化镁的比活性显著高于在甲酸和甲醇中提取的真菌酶的比活性。赵等人从污染土壤中分离到一株甲醛降解菌，鉴定为副球菌属，降解动力学为一级模型。沢田等人成功地从盆栽金底栖动物栽培土壤中分离出一种真菌。经ITS-5.8S rDNA序列分析，确认为木霉菌。其他微生物如酵母、大肠杆菌、甲基杆菌、松果体等也被发现有良好的甲醛降解性能。然而，他们中很少有人这样做过实际应用。

本研究的目的是分离甲醛降解菌，并对其形态、生理和生化特性进行研究。在接种有该功能微生物的诱变生物过滤器中评价辐射特性。然后用两种不同的生物降解模型来模拟细菌去除甲醛的过程。本研究结果可为处理大量低浓度甲醛提供参考。

材料和方法

培养基

本研究制备了两种不同组成的培养基，即全营养培养基(FN)和矿盐培养基(MS)。全营养培养基和矿盐培养基分别用于丰富目标微生物的微生物群落和分离甲醛降解菌。全营养培养基由5 克每升牛肉提取物、10 克/升蛋白胨、5 克 /升氯化钠和20 克 /升 琼脂配制; 矿盐培养基为2.16 克 /升磷酸氢二钾, 0.85克/升磷酸二氢钾, 1.05 克/升氯化铵, 0.1 克/升硫酸锰, 0.05克/升一水硫酸锰, 0.01 克/ 升七水硫酸亚铁和0.03克/ 升二水氯化钙. 2 摩尔/升 氢氧化钠和氯化氢调节两种介质的最终pH至7。培养基然后用高压灭菌法110摄氏度度消毒30分钟。

目标微生物的富集、分离和驯化

从家具厂废水中提取活性污泥，用于甲醛降解菌的富集和分离。收集大约10克活性污泥，加入到含100毫升全营养培养基的250 毫升锥形瓶中。为了分离甲醛生物降解菌，先搅拌全营养培养基，然后静置20分钟。然后将全营养培养基上清液接种到MS培养基中，加入1克/ 升甲醛，在30 摄氏度下以每分钟120转速的摇瓶中甲醛在培养基中完全消失，用新鲜矿盐培养基进行连续稀释，从富集培养基中筛选出甲醛降解菌。最后,将甲醛降解细菌培养于甲醛浓度增加的新鲜的矿盐培养基中 (从0.1 克/升到1.7 克/升增加0.2克/升每次)48小时，30摄氏度，每分钟120转在摇床上培养。

利用稀释电镀用于进一步纯化。稀释后的菌液置于固体全营养培养基板上，在培养箱中培养2天。每个菌落都进行数目标记，并通过反复交叉分离纯化。因此，我们通过筛选获得了纯菌，保证了产品中的甲醛降解稳定性能的剩余研究。

细菌鉴定

分离出的甲醛降解菌株按照伯杰氏细菌鉴定学的手册的程序进行了形态、生理和生化的表征研究。用CTAB (十六烷基三甲基溴化铵)提取总基因组DNA方法。聚合酶链反应(PCR)扩增其(内部转录空间)区域进行了佩尔蒂尔热循环PTC0200 (BioRad实验室公司，美国)使用的是通用引物。PCR反应在25 m l体积中进行，其中包含约30 ng基因组DNA，2*Easy Taq PCR SuperMix (TransGen Biotech Co.，China)，每个引物1.0 m l (2.5 微升)，蒸馏水去离子水。PCR扩增反应在以下条件下进行:在94摄氏度 1分钟进行30个DNA循环周期;然后在90摄氏度时将物质与DNA结合1分钟;最后,在72摄氏度时用聚合酶复制DNA 两分钟，PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳分离。纯化后的PCR产物由中国科学院微生物研究所直接进行双向测序。

实验装置

在直径为108mm、高度为1500mm的有机玻璃滴入式生物滤池中，对分离得到的细菌进行了生物降解特性评价。实验原理图如图1所示。该生物滤池由三个高度相同的300毫米的模块和相邻的间隔组成，模块为100毫米。滴滤池的有效容积为8.24 升。

本研究中使用的包装材料是一种复合填料，采用压铸挤出造粒技术，与各种有机和无机材料结合。即以碳酸钙(CaCO 3)、水泥、珍珠岩、植物纤维和水玻璃为粘结剂。该填料的物理性能如下:粒径为11 mm，容重为471克/立方米，比表面积为3.91平方米/克，孔隙率为40%。关于包装材料的制备和特性的更多细节可以在我们之前的论文中找到相关内容。

生物宏观动力学

假设微生物均匀分布在包装材料上，需氧呼吸不是限制因素，塔流为推流，则微生物对甲醛的降解行为可以用米氏方程表征: RC=（RC m * C ln）/（K m C ln）

其中RC为甲醛的去除能力，RC m为甲醛的最大去除能力，C ln为甲醛的对数平均浓度; C ln = （C i - C o）/ ln（ C i /C o）,Ci进气浓度,和C o是出口的甲醛浓度分别和K m是一个饱和常数。当甲醛浓度抑制去除能力时，霍尔丹模型更适合描述这一趋势:

RC=RC m C ln/（Km C ln （C 2ln K l）

其中RC m *为不考虑抑制的最大去除能力，K m为饱和常数，K l为抑制常数。本文使用的定义和方程如表1所示。

结果与讨论

细菌的驯化和鉴定

经反复富集纯化，分离出5株命名为B1、B2、B3、B4、B5的菌株。在一定甲醛浓度下的去除率如图2所示。当甲醛降解率分别为30.92%和40.98%时，菌株B2和B3的甲醛降解能力较低。经过4天的摇匀培养，添加B2的培养基中甲醛浓度增加。有可能是引入了少量的室内环境甲醛。其他三种细菌的甲醛降解率均大约为60%，但可以看出B1对甲醛的降解有明显的优势。因此，选择B1菌株作为后续实验研究的对象。

菌株B1在30 摄氏度经过二十四小时培养菌落呈圆形，有边缘，表面光滑湿润，透明、粘稠、有光泽、凸出、乳白色。扫描电镜下观察到菌株B1为无孢子、杆状、不动、革兰氏阴性。菌株B1的特性如图3所示。形状为直杆菌或弯杆菌，无螺旋的细胞，宽度0.7-1.1 微米，长度2.0-2.4 微米;它们既不显示叶柄，也不显示鞘。

利用上述方法测定了细菌的多项生理生化指标，结果如表2所示。

甲醛降解菌株B1基因序列分析是由中国科学院微生物研究所进行; 所测菌株的16rRNA与恶臭假单胞菌的同源性为99.8%。根据对B1菌株形态和生理生化特征分析，判断B1菌株属于假单胞菌属。

不同进口加载速率下的生物降解

进口负荷是影响废气生物反应器性能的重要参数。在这里，我们每一次只研究一个因素的影响。以甲醛浓度稳定(400毫克/立方米)、入口气流变化(10- 400升 /小时)为研究入口负荷的影响。结果如图4所示。

从图4可以看出，当进口负荷低于38.9 毫克/ 升/小时，甲醛的去除率保持在90%以上。然而，当进口加载速率增加到48.5毫克/升/小时，净化效率显著下降，当进口加载速率增加到58.25毫克/升/小时和67.96毫克/升/小时，净化效率显著下降,去除率分别下降到54.65%和48.33%。观察大量线性增加清除能力随着进口的增加从0.49毫克/升/小时到67.96毫克/升/小时,而在高加载阶段,去除能力没有增长,剩下约35毫克/升/小时,对应去除率较低。

在此过程中，随着进口负荷的增加，进气流量也随之增加，甲醛去除率基本完全降低。这一结果可能是由于生物滤池内的气体流速随着气体流量的增加而增加，从而促进了气体向液相的转移。但另一方面，当气体流速过大时，停留时间缩短，这种情况不利于微生物的吸附和降解。另一方面，增加气流也会减少甲醛对生物膜的吸附作用。这些结果都对甲醛的去除产生了负面影响。

不同操作条件下微生物的变化

滤池内的动态微生物种群可以对滴流塔的运行条件做出反应，从而直接反映甲醛的降解效果。大约每20天从过滤器的每一层中去除包装材料，然后用平板稀释法测量附着在包装材料上的生物量。为了模拟由于不可预知的原因造成的生物滤池操作故障的趋势，通过停止添加营养液和甲醛气体以及所有其他能源供应来创建一个装置的空闲期。大约30天后，生物滤池重新启动。并测定了重新启动前后附着在填料上的微生物量，研究了生物滴滤塔的回收能力。生物滤池中每个填料层在不同阶段附着的微生物总生物量如图5所示。

从图中可以看出，生物滤池在运行条件下非常稳定。在提供甲醛后，由于甲醛提供碳源，微生物数量增加，而循环喷雾液提供生长繁殖所需的营养物质。两个月后,生物过滤塔的操作中断了30天，然后重新开始。由于营养物质和碳源的缺乏，一些细菌逐渐死亡，导致包装材料中的生物量减少。但3-5天后恢复运行后，两者的去污效果和生物滤池的微生物量达到了关闭前的水平。这些结果表明，微生物具有很强的适应性和回收能力，直接影响生物滤池的性能。

我们用扫描电子显微镜观察微生物种类的变化。设置前、运行中、空闲期间和重启后的扫描电子显微图像如图6所示。在圆形和方形内分别是功能性微生物和杂类细菌。对比图(a)和(b)可以看出，在使用前和使用过程中，附着在填料上的微生物几乎没有变化，说明B1菌株是生物滤池中的优势菌种。从图b和图c的对比中我们可以看出，由于没有甲醛通过生物滤池，其他种类的微生物也可以在塔的环境中生存，所以在闲置期之后，会有更多的微生物附着在包装上。观察图(d)，发现滤塔经过甲醛气体还原后，菌B1再次成为填料上的优势微生物。也就是说，由于甲醛的毒性会使其他微生物失活，使得细菌B1具有持续快速繁殖的优势。这些因素都说明筛选细菌B1的实验是成功的。甲醛降解菌不仅能在富甲醛环境中生存，而且具有很强的稳定性;为生物滤池塔降解废气中的甲醛奠定了基础。

动力学分析

去除能力相对于log平均浓度cln的变化如图7所示。米氏方程和霍尔丹模型(见表1)用于描述这种降解行为。表3总结了两种模型得到的生物降解动力学参数值。

去除能力在低Cln范围内显著增加，但在高Cln范围内有所下降。这一结果与两个模型的拟合结果一致，霍尔丹模型的r2(0.964)优于米氏方程模型(0.846)。Hernandez等人在研究硫化氢的生物降解时也得出了类似的结论。

结论

本研究从家具厂废水产生的活性污泥中分离出甲醛降解菌，并在滴流式生物滤池中对相关的生物降解特性进行了评价。从实验中可以得出以下结论。

（1）观察到菌株B1为非孢子形成、杆状、不动和革兰氏阴性。基因测序分析表明，菌株B1属于假单胞菌属。

（2）进口负荷对甲醛降解性能有显著影响。菌株B1在进口负荷为38.9 mg L -1 h -1以下时，甲醛去除率较高(90%以上)。但当进口负荷为60mg L -1 h -1时，去除率下降到50%以下，且去除能力趋于饱和。

（3）附着在包装材料上的微生物性能稳定，适应性强，回弹性好。菌株B1在生物滤池中表现良好，生物量稳定。此外，在生物滤池操作中断30天后，它很快成为主导细菌。

（4）与米氏方程模型相比，由于细菌受到底物的抑制作用从而使霍尔丹模型更加适应于这一个实验。

感谢

感谢国家重点研究开发项目(No. 2017yfc0212400)、国家自然科学基金(No. u1304216)、河南省科技计划(No. 122102310366)、国家博士后科研基金(No. 2018M632794)的支持。

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