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基于FPGA的直接数字频率合成任意光刺激波形叶绿素荧光测量系统
摘要
目前，为了解决由多种生物和非生物因素造成的粮食短缺问题，关键是要产生可应用于农作物的技术。众所周知，胁迫条件影响光合活性，而光合活性与作物产量密切相关。因此，叶绿素荧光可以作为研究光合生物生理和胁迫条件的合适分析工具，并对其进行改良。提出了一种基于FPGA的叶绿素荧光直接数字合成测量系统。这是通过一个可定制的波形处理器来实现的，该处理器能够实现任意波形来调制光源，获得新的频率成分来丰富光合样本能够产生的信息，并为研究人员提供获取生理信息的新方法。
关键词：叶绿素，荧光反应，仪表，FPGA，直接数字频率合成，任意波形
1.引言
最近，粮食生产受到一些生物和非生物因素的影响，这些因素在数量上直接影响到不发达国家。根据粮农组织2013年的统计，有8.42亿人营养不良，特别是在非洲国家，有65%的人口患有营养问题[1]。因此，产生可应用于作物的技术是关键，以抵消目前产量不足的问题。众所周知，胁迫条件影响光合活性，这与作物产量密切相关[2]。因此，人们正在努力了解植物的生理学。其中一个途径是光系统I（PSI）和光系统II（PSII）产生的荧光，它们对环境胁迫非常敏感[3]。这是因为光合有机体拥有由类囊体膜和两个光系统形成的叶绿体。这些是产生叶绿素荧光（Chlf）的原因。然而，PSI只起到了微不足道的作用PSII是可变荧光的主要贡献者[4]。因此，叶绿素荧光可以作为研究光合生物生理和胁迫条件的合适分析工具[5]。
为了创造新的技术来提高初级部门的生产力，有必要进行更有效和非侵入性的测量，如Chlf荧光计。这主要包括使用PAR（光合有效辐射）光源对光合产物诱导叶绿素激发，从而通过荧光探测器装置获得荧光[6]。有几种Chlf荧光测量方法，其中高速率对于测量快速光合过程很重要；例如，测量Chlf的快相，这比慢相或延迟荧光（DF）更容易分析。这通常用于表征PSII光化学的光化学量子产率。快相可分为四个部分或亚相称为“OJIPcurve”，不包括原点、两个半态J和I，最后是P（峰）。被称为光化学相的O-J上升大约达到2毫秒。J-I和I-P往往要低得多，被称为几十毫秒量级的热相，最终以T结束，如图1[4]所示。
图1 叶绿素a荧光诱导瞬态，分别在叶表面每平方米每秒激发波长650nm和3200lmol光子（改自[4]）。
有一些基本的方法，如泵和探针，使用不同强度的氙闪光。主要缺点是闪光灯的充电延时[7]。尽管快速重复频率荧光计（FRR）的频率增加到了100hz，但与光合过程相比，它的频率较低[8]。为了提高荧光响应率，研制了荧光诱导和弛豫（FIRe）光源，实现了多色光源，以提高其获得Chlf弛豫动力学产率的能力[9]。然而，PAM（脉冲幅度调制）是应用最广泛的荧光计之一[10]，它基本上是一组光信号脉冲和饱和闪光，用于对暗适应和光适应样品进行测量[11]。不幸的是，上述方法是刚性的，不允许修改光源强度。由于这一局限性，商用设备需要不同的光源器件来诱导不同的光照条件，这就需要测量叶绿素荧光的不同状态。因此，在使用测量系统时，这降低了便携性并增加了能耗。此外，商用设备不允许用户操纵光源的经典脉冲波形或光激发脉冲的速率；因此，限制了对新现象的研究。所以，有必要创造新的可定制的方法学，为了解光合样品的生理条件提供新的途径。为了满足这一需要，重要的是修改光源的操作，从而改进目前大多数技术使用的开关控制[12,13]。这意味着光源的波形调制允许用户获得新的Chlf特性，例如光源和荧光响应之间的幅度和相位现象[12]。基于这一原理，有可能通过数字信号处理的频谱或统计技术，如快速傅立叶变换（FFT）、频谱图、熵或反褶积，为Chlf测量创造新的替代方案[14]。
本文的新颖之处在于利用荧光作为分析工具，并描述了基于直接数字合成（DDS）能力的Chlf测量系统的开发[8,15–18]。这是通过一个可定制的波形处理器实现的，该处理器能够实现任意波形来调制光源，以改善开关控制，如前所述[19–21]。其主要特点是获得新的频率成分，丰富光合样品所能产生的信息，从而为研究者提供获取生理信息的新途径。更具体地说，提供一个基于FPGA（现场可编程门阵列）软核的通用可定制测量系统，这将比目前正在使用的其他技术具有许多优势。其中包括重新配置、高并行计算速度，以及集成在单个芯片和定制架构中，仅举几个例子[22]。用DDS实现了以下四种主要波形：首先，由于正弦波形是最纯净的，由单一的频率和幅度组成。然后利用三角形锯齿波，在其突变波形中加入高频分量。最后得到一个方波，高频分量增加更多。值得注意的是，最后的波形与开关控制不同，因为使用DDS，即使在较低的状态下，Chlf也会被激发。此外，所有的信号都是用各自的频率扫描来实现的；因此，测量系统将能够同时获取Chlf和光源激励信号，以便在统计上比较两个信号之间的显著变形。
2.理论背景
Chlf是一种红色和远红外辐射，用于监测由PAR光源激发的光合组织产生的光合作用。组织会重新发射波长更高的光子，特别是在685nm附近的光谱区域，而其他光子则在730nm附近[23]。这种现象是热化学和光化学耗散之间能量过剩的耗散途径，叶子必须拒绝不能吸收的多余能量。汉斯W考茨基和他的合作者A赫什在1931年描述了Chlf，也被称为考茨基效应。他们观察到，当暗适应（DA）时，光合活性样品在黑暗中保持15分钟到1小时，然后被照亮，产生Chlf增加。此外，这一增长与二氧化碳同化相比较，产生了质的相关性[24]。
所有的植物，从高等植物到单细胞绿藻，都具有叶绿体和类囊体膜，其中含有PSI和PSII，并与细胞色素b6f复合物相互连接。这两个光系统进行光合反应和相关的电子传输。在DA样本上，PSII和PSI受损是因为暗光合机构处于非功能状态。照射后，再次采集样品，几分钟后诱导两个光系统之间进行光合作用电子传递反应所需的合作。因此，允许适当的水分解、氧气释放以及NADP 还原和ATP[11]。
如前所述，PSII是Chlf的主要贡献者，由叶绿体类囊体膜中的色素和蛋白质组成，是胁迫的主要靶点。Chlf暂态过程分为两个阶段：瞬发阶段和延迟阶段。第一个发生在几秒钟内，通常也被称为以T结束的OJIP阶段，如图1所示。如前所述，该相可将由O–J形成的光化学物质和由J–I–P瞬态组成的非光化学物质分开。光化学作用直接取决于激发光的强度，而非光化学作用主要由PSII能量的激发依赖性热耗散机制控制[25]。对OJIP曲线进行了数学分析，以预测J级必须经历一次以上翻转的闭合PSII中心部分。另一方面，Joliot和Joliot在1964年[26]报道了荧光产率（ФF）由开放反应中心分数（q）的非线性函数导出。此外，理论模型显示了与q的双曲关系，如下所示：
P是连接性参数定义为激发能从封闭的PSII反应中心转移到相邻反应中心的概率；而x是介于0和1之间的值，其中0是“水坑”模型，1是“湖”模型，这意味着假定所有PSII单元相互连接。因此，p2g直接依赖于不同PSII天线域之间的激励传输概率。此外J=CHYP=p2g (Fm/Fo -1)表示乙状结肠参数[27]。
另一方面，延迟期是一个更长的荧光期（以分钟计）；因此这是一个潜在的光合作用效率和植物胁迫的指标，因为即时期的不同，其中单个分子足以产生。延迟荧光依赖于系统相互作用。此外，它还广泛用于检测除草剂和解决干旱问题[28]。
因此为了解释荧光诱导动力学，定义了几个参数，其中最常见的是起始Fo和最大Fm。在此基础上，利用了Fm/Fo比值，并在样品未受应力时产生了较高的值。然而，在图形表示中，广泛使用当时的相对变量荧光，其定义见式（4），即Fo和Fm之间的时间间隔t处的相对变量荧光[3]。此外，识别光适应荧光响应的值是存在的，用Fmrsquo;表示的荧光响应通常低于Fm，而用Forsquo;表示Fo，这取决于植物种类。尽管如此，通常假设Forsquo;=Fo来忽略这种变化。
定义所有参数的目的是以定量的形式确定样本中的生理问题，如表1所示；然而，并非所有的压力都以相同的方式表现出来。在低温胁迫下，新陈代谢受到很大影响，破坏了PSII，降低了光化学的最大量子产率。这是在公式(5)中表示的，它是由减去最大的光来表示适应荧光和荧光的起源对暗适应。另一方面，高温影响类囊体，使PSII失活，导致Fo的升高，影响了暗适应叶片的最大PSII效率。这可以在公式(6)[29]中看到。由于营养问题，特别是缺乏氮(叶绿素产生[30]的主要微量营养素)，PSII的操作效率和光化学在开放反应中心的量子效率降低，如方程式所示。(7)、(8)分别修正自[31]。
其中Fq是Fmrsquo;和F之间的差，F是DA中Chlf的稳态条件。
表1 叶绿素荧光命名定义
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荧光命名 含义 |
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F |
暗适应荧光稳态 |
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Fo |
最小荧光（暗） |
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Fm |
最大荧光（暗） |
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FV |
可变荧光（暗） |
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Forsquo; |
最小荧光（亮） |
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Fmrsquo; |
最大荧光（亮） |
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FVrsquo; |
可变荧光（亮） |
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Pq |
Fmrsquo;与F的差值 |
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ФF |
荧光产率 |
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Q |
开放反应中心分数非线性函数 |
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p |
封闭PSII反应中心激发能量转移概率 |
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omega; |
PSII单元互连状态 |
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P2g |
不同PSII天线域间的激励传递概率 |
3. 测量系统设计
3.1 Chlf的光谱响应
为了设计测量系统，必须考虑上述Chlf的光谱响应。众所周知，蓝色光源适合叶绿素吸收，这就是为什么使用了两个超亮蓝色LED LZ4-40b200（LED引擎）[32]。此外，在测量系统中，有必要建立一个工作在335–610 nm波长的彩色玻璃带通滤波器FGB37S（Thorlabs公司），用于光源。因此，避免了Chlf测量中的红外噪声叠加，允许分离任何可能干扰并导致错误测量的发射。此外，如图2b所示，在光电二极管上安装了FGL695 nm有色玻璃滤光片（ThorLabs公司），其抑制波长小于695nm的长通（ThorLabs公司），以仅获取Chlf信号。由于隔离室提供的光控制条件，长通滤光片足以用于该测量系统。这是使用高反射表面进行测试，以确保来自led的光被Chlf光电二极管最低限度地获取。然而，再加上Chlf，还有一些信号不容易排除。然而，这些可以提供关于样品生理状态的信息，例如在Chlf的相同区域中的反射率[33]。因此，为了验证所提出的Chlf测量系统，使用光谱仪Acton系列SP 200i（普林斯顿仪器）来表征荧光系统响应，如图2a所示，并比较叶绿素吸收和荧光，这是基于正确选择LED和光电二极管。
图2（a）光源和Chlf的排放及其滤光片。（b）叶绿素吸收和发射光谱（修正自[32]）。
3.2 实验装置
测量系统分为激励和检测两个主要阶段。第一种是通过DDS在FPGA的RAM中实现的数字波形。这就是为什么开发了一个基于MATLAB R2013A[34]的接口，该接口能够通过DDS产生一个随机存取存储器（RAM），能够在FPGA中实现任意波形，如图3所示的主测量系统图所示。
为了提供模拟信号，使用了DAC7565（德州仪器的数模转换器）。由于DAC提供的低功率信号，采用了OPA453（德州仪器）高压运算放大器作为非逆变放大器。然而，由于1400毫安的电流要求，有必要实现一个达林顿放大器MJ1106G（在半导体上）在共同的集电极结构下工作，其目的是保持几乎相同的电压，增加电流并达到标称值，以便从LZ4-40b200获得高亮度调制光（LED引擎），如图3所示。
在检测阶段，避免直接从为LED供电的电信号获取参考信号是至关重要的。这可能会由于光电二极管和LED延迟而产生相移。参考光和荧光光是光信号是必要的。这就是为什么要实现两个光电二极管（OPT301，德州仪器）以便更好地进行比较；然而每个光电二极管检测到的光具
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