猪和鸡胃蛋白酶蛋白水解比较外文翻译资料

 2022-08-15 17:13:32

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猪和鸡胃蛋白酶蛋白水解比较

艾琳（Irene Crevieu-Gabriel）*，乔尔·戈麦斯

（Joelle Gomez），让·保罗·卡芬（Jean-Paul

Caffin），伯纳德·卡雷（Bernard Carre）

法国家禽研究协会，努伊兹中心，伊兹里市37380

（1998年12月24日收到； 1999年5月17日通过）

摘要本研究的目的是比较猪（PP）和鸡（CP）胃蛋白酶的蛋白水解程度，以查明是否可以

使用PP代替CP来模拟鸡的胃液水解。首先，使用三种底物比较了两种胃蛋白酶的pH活性。对于血红蛋白，CP的最佳pH分别比PP，2.5-3和2略高。对于两种植物蛋白来源（豌豆，小麦），两种酶的最佳pH值相似，约为pH 1.5。对于测试的三种底物，CP在比PP更宽的pH范围内表现出高水平的活性。其次，研究了在接近鸡胃pH（1.5-3.5）的pH水平下，两种胃蛋白酶对两种植物蛋白水解的敏感性。对于PP，豌豆蛋白比小麦蛋白水解更多，而对于CP，水解取决于pH值。因此，研究的两种蛋白质来源的分类取决于酶的种类和pH。这项研究的结果表明，必须谨慎选择用于评估蛋白质消化率的体外水解条件。

体外蛋白水解/胃蛋白酶/猪/鸡

猪胃蛋白酶和鸡胃蛋白酶水解蛋白质能力的比较，本研究的目的是比较猪胃蛋白酶（PP）和鸡胃蛋白酶（CP）的蛋白水解程度， 以确定PP是否可以代替CP模拟鸡的胃水解。 首先，在三种底物上比较了这两种蛋白酶的活性谱作为pH值的函数。血红蛋白CP的最佳pH值略高于PP，分别为2.5 -3和2。对于两种植物蛋白来源(豌豆、小麦)，水解的最佳pH值相似，即pH1.5。有三个子层。CP在比PP更大的pH范围内表现出显著的水解作用。在第二阶段，研究了两种蛋白酶在接近鸡肠胃(1.5-3.5)的pH值时对两种植物蛋白的水解。在PP中，豌豆蛋白比啤酒蛋白水解得更好，而在CP中，结果取决于ph值。蛋白质研究对象的分类来源取决于原始动物酶利用等。体外水解的蛋白质预测方法的结果在体外证明了水解的条件和注意事项。

体外水解蛋白/胃蛋白酶/毛孔/多孔

1. 介绍

为了配制用于动物营养的饲料，有必要了解饲料的氨基酸消化率。建立多种常用饲料的氨基酸消化率系数表[24，25]。但是，同一饲料的不同样品之间存在很大差异。因此，需要体外测定以预测饲料成分的蛋白质消化率。为此已经进行了许多研究。在大多数情况下，用于预测消化率的条件（例如温度，pH和时间）是在哺乳动物的消化道中满足的条件，而不是鸟类[9，11，26]。但是，这两个门在消化生理上显示出差异。鸡的体温略高，约40oC，而不是猪的37oC。沿着消化道的pH值不相同[5、15、21]，并且根据pH值，蛋白质具有各种结构，这可能导致各种水解敏感性。在鸡中，到小肠末端的运输时间短于猪，对于可溶性化合物大约为4 h，对于不溶性化合物大约为6 h [32]，比在猪中，可溶性化合物大约为5h30分钟，对于可溶性化合物为14h 30 min。不溶性化合物[7]。而且，禽类酶的特性与母系马来酶相比揭示了活性和抑制剂敏感性方面的差异[3，17-19，28]。在多种单酶或多酶体外方法中，胃蛋白酶水解法似乎可以作为预测体内动物蛋白质量的快速方法[2, 26].它也与植物蛋白一起使用[11，16]。但是，尽管有种种研究表明不同物种的胃蛋白酶显示出不同的酶促性质，但不管使用哪种物种，都使用猪胃蛋白酶（主要由胃蛋白酶A组成）[3，22，28]。由于文献中的某些差异，因此未考虑这些研究。例如，根据一些研究，禽胃蛋白酶（大约只有一种在鸡中命名为胃蛋白酶A [18]）似乎在pH值接近3时对血红蛋白具有最佳活性，而猪胃蛋白酶则为2 [3，33] ，35]。相反，Levchuk 和 Orekhovich [22] 和 Pletschke等人。[28]观察到与禽和猪胃蛋白酶相似的血红蛋白最佳pH值。因此，需要更多的研究来澄清这一争议。另一个需要考虑的问题是胃的pH值，它随物种和采食量的不同而变化：在空腹或随意喂食商业饲料的鸡中，砂壤的pH约为2.5 [12，15]，而在猪的胃中则为pH进餐后的时间在1.8到5.8之间[21]。目前的工作是使用血红蛋白作为典型的蛋白酶底物来比较猪和鸡胃蛋白酶的pH活性曲线[1]。此外，与以前使用简单蛋白质来源（酪蛋白或血红蛋白）或合成化合物作为底物的研究相反，我们研究了胃蛋白酶在各种pH值下的水解，这些水解是使用单胃喂养中常用的植物蛋白（豌豆和小麦）进行的。选择这两种蛋白质来源是因为它们的蛋白质组成非常不同。豆类主要由白蛋白和球蛋白组成，而谷物则是由麦胶蛋白和谷蛋白组成。讨论了通过体外水解评估蛋白质消化率所观察到的结果的序列。

2. 材料和方法

2.1. 化学制品

使用的所有化学品均为分析纯。戊巴比妥钠购自赛诺菲（法国玛恩拉科凯特）。Tris 乙酸钠，NaOH，氰化钾和茚三酮购自Merck（法国马恩河畔的诺金特）。硫酸铵，碳酸氢铵和 乙酸钠盐分别来自Prolabo（法国Fontenay-sous-bois）。乙酸和2-甲氧基乙醇由Prolabo提供。Sigma（Saint-Quentin Fallavier，France）提供三氯乙酸（TCA）以及血红蛋白（H-2625）和牛血清白蛋白（A-4503。猪胃粘膜的胃蛋白酶来自Merck（7190）。

2.2. 植物蛋白来源

通过空气分级获得的豌豆浓缩物和重要的小麦面筋分别由GEMEF和Roquette提供。它们呈细粉形式。由凯氏定氮法测定的氮含量可估算出这两种产物的蛋白质含量。使用的氮到蛋白质的转化因子6.25。

2.3. 生物材料

从24日龄的肉鸡鸡（鸡 （ Gallus gallus），品系JV 915和白罗斯）获得腺胃。禁食鸟类以在最终产品中获得更高的胃蛋白酶活性[3]。禁食过夜后，用心内注射戊巴比妥钠（每只禽1毫升）杀死家禽。死亡后立即恢复摄食。去除了可见的脂肪，但粘膜太脆而无法剥离。将器官用冷蒸馏水洗涤，并在塑料盒中的冰上保存最多30分钟，并在-200oC下冷冻，在需要时将其保存。

2.4.鸡胃蛋白酶原的制备

使用Yasugi和Mizuno [35]以及Pichova 和Kostka [27]的逐步盐析方法（经过一些修改）获得了鸡胃蛋白酶原的粗提物。由于粘膜太脆弱而无法剥离，因此整个小肠被用作胃蛋白酶基因的来源。所有后续步骤均在0至4oC下进行。将冰冻的腺胃（80g）切成小块，并用混合器（Ultraturrax IKA ）在 250 mL 烧杯中的 160 mL 0.4 M Tris乙酸盐缓冲液pH 8.6中匀浆。将匀浆液在4oC下以11000 g离心30分钟，然后用25％，45％和80％的饱和硫酸铵溶液从上清液中逐步将酶原盐析。以11000 g离心10分钟后，将第二和第三次盐析步骤的沉淀物合并并溶于80 mL在pH 7的JO mM NH4 HCO3中将溶液在4oC下对溶解缓冲液透析48小时，每天两次更换缓冲液。然后将溶液冷冻干燥并储存在-20oC.

2.5.胃蛋白酶在不同pH值下对血红蛋白的活性

根据Anson [1]的方法进行了一些修改，确定了胃蛋白酶活性。在10 mL试管中使用2.5 mL酸变性的血红蛋白（2％）进行水解。在不使用缓冲液的情况下，用0.1 M NaOH或1M HCl通过0.5步将反应混合物的pH调节至1至 5的pH值范围[3]，并调节体积，以使每种管将是相同的。在初步实验中确定所需酸或碱的体积。在使用前，准备了酶溶液在0.01 M HCl中，对于鸡胃蛋白酶原，将溶液在室温下静置10分钟以激活酶原[3，27，35].用0.01M NaOH中和酶溶液，并用水稀释。 由于猪和鸡胃蛋白酶分别在6-6.5和7.5-8以上的pH值失活，因此这些溶液的最终pH值约为5且从未超过6.5 [3]。将酶溶液（0.5 mL，120 micro;g/mL）添加到血红蛋白溶液（最终重量比E / S：1/820）中，并控制最终的pH值。使水解在恒温控制的水中进行1O min。在40oC下水浴，这与鸡的体温相对应。如标准测定中那样，通过添加5mL的10％TCA（最终浓度：2.7％）来终止反应，并使其在4℃下静置。通过在酶溶液之前加入TCA来制备空白。在4oC下以10000 g离心10分钟后，将TCA沉淀物丢弃。TCA可溶性产物的吸光度在280 nm处测量。对于测定的线性度，可以确定测试与空白样品在280 nm处的吸光度差异小于0.8 [4]。每个pH的活性计算如下： 一个蛋白水解单位定义为产生280 nm吸光度增加的酶量。在测定条件下，每分钟0.001。对于pH活性曲线，它表示为每种酶最大活性的百分比。在一个pH值下，每次水解均进行三次反应。

2.6. 比色蛋白测定

溶液中蛋白质含量的测定是根据Landry和Delhaye的改良方法进行的[20]。该测定避免了低分子量化合物的低估。将50微升的8 M NaOH加入150 micro;L的聚丙烯聚丙烯螺纹管（2 mL）中的样品中，并安装由Starsted（德国Niimbrecht）提供的O型圈螺帽。将它们紧密密封，然后在干式加热器（Pierce）中加热到130oC（plusmn;0.5oC）120分钟。冷却后，将它们离心（3000 g，3分钟）以旋转浓缩在瓶盖高度的水。将以下物质添加到每个系列的试管中：100micro;L 40％（v / v）乙酸，400 micro;L 60％（v/ v）2-甲氧基乙醇和150 micro;L 0.2 mM氰化钾乙酸盐Rosen缓冲液[31]稀释两次。还添加由0.01 M.茚三酮的储备溶液（150mu;L的2％甲氧基乙醇中的3％（p / v）溶液）制备的氰化钾溶液。每次添加之后进行涡旋。然后将管密封并在100oC的干式加热器中加热15分钟。在室温下冷却并在加热结束后等待不到1小时后，在570 nm下测量溶液的吸光度。通过仅溶解样品介质和试剂来制备空白。牛血清白蛋白（0-50micro;g-mL-1范围）用作标准蛋白。

2.7. 胃蛋白酶水解不同PH值的豌豆和小麦蛋白质的合成

对蛋白质悬浮液进行水解。使用了包含磁力搅拌棒（350 rpm）的100毫升锥形瓶。向每个锥形瓶中加入20 mL的0.01 M HCl。将它们在恒温控制的水浴（40oC）中培养，并用橡胶塑料封闭。当达到正确的温度时，加入等价的约200 mg蛋白质（精确度为0.1 mg）。将豌豆浓缩液或小麦面筋悬浮10分钟，并如上所述调节pH值（请参阅第2.5节）。如上所述制备酶溶液（ 4mL，0.6mg-mL-1）（参见2.5节），并添加到蛋白质悬浮液中（最终重量比E / S：1/80）。然后，使水解在40℃下进行10分钟。加入三氯乙酸至终浓度为10％，而不是2.7％，这是以前用于血红蛋白的终止反应，因为低三氯乙酸浓度在沉淀所测试的蛋白质（尤其是豌豆蛋白质）时效率低下。通过在酶溶液之前添加TCA来制备空白。使样品在4℃下静置。将TCA沉淀物在4℃以10 000 g离心10分钟后弃去。由于物质特别干扰豌豆浓缩物（核酸，黄素，皂苷，维生素等极性颜料），因此无法使用280 nm处的吸光度。用豌豆浓缩物和小麦面筋分别用蒸馏水稀释至1/20和1/10后，通过上述蛋白质测定法（见2.6节）测量TCA可溶产物（TCA终浓度为分别为0.5％和1％）。水解度通过释放的TCA可溶产物测量。数据表示为最大水解的百分比。在特定的pH下重复水解。

2.8. 蛋白质溶解度

在植物蛋白的酸性条件下将相当于约200 mg的蛋白质悬浮在100mL锥形瓶中的22.5 mL HCl，pH 1.5、2.5 或 3.5 中，并在 40oC 下孵育。通过以350rpm的磁力搅拌将混合物均质化10分钟。用HCl调节pH值。样品将其在环境温度下以9000 g离心10分钟，并在1/50稀释后如上所述测定上清液。数据表示为每100 mg初始蛋白质的溶解蛋白毫克数。

2.9. 体外胃蛋白酶水解豌豆和小麦蛋白质的动力学特性

在40oC的水浴中，在100 mL锥形滤杯中，在22.5 mL HCl pH 1.5、2.5或3.5中，将相当于200 mg的蛋白质（精确度为0.1 mg）加入水浴中。通过以350 rpm的磁力搅拌将混合物均质化10分钟。如前所述，用HCl调节pH值，然后加入2.5mL的猪或鸡胃蛋白酶/ HCl（550UmL-1，参见2.5节）（对于pH水解曲线，最终重量比EIS为约1/80）。对于每个pH，水解动力学进行60分钟。此外，在每个pH值下也一式三份进行了20和50分钟的其他水解。在添加酶之前（时间0），此后以不同的时间间隔，从样品中一式两份地取出400 micro;L悬浮样品。锥形反应被预先终止在10％的最终TCA中沉淀蛋白质。喷射样品至4oC静置，并以9 000 g离心10分钟。在1/50稀释后，如上所述测定上清液。数据表示为每100 mg初始蛋白释放的三氯乙酸TCA可溶性寡肽毫克数。

2.10.统计分

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