亚精胺减轻盐分对苜蓿抗氧化酶活性及基因表达的影响外文翻译资料

 2022-08-19 15:56:26

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附录A： 外文译文

亚精胺减轻盐分对苜蓿抗氧化酶活性及基因表达的影响

楼艳红：关瑞；孙明杰；韩飞；何伟；王辉；宋福鹏；崔秀敏；诸葛玉平

接受：2018年9月4日

施普林格科学商业媒体有限公司，是Springer Nature 2018的一部分

摘要

我们研究了施用亚精胺(Spd)是否减轻了盐胁迫对紫花苜蓿(Medicago SativaL)的伤害，并探讨了与胁迫相关的离子平衡、抗氧化代谢和基因表达相关的防御机制。我们测定了30天龄紫花苜蓿在水培试验中7天的反应，并进行了6个处理之一：半强度Hoagland溶液(对照)、1%NaCl、10micro;M Spd 1%NaCl、20micro;M Spd 1%NaCl、40micro;M Spd 1%NaCl和60micro;M Spd 1%NaCl。在盐胁迫下，叶绿素b、叶绿素a b和总蛋白显著降低，而相对电解质渗漏率、H2O2含量、谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、谷胱甘肽还原酶(GR)活性、Na/K比值以及APX1、APX2、GR和SOD基因表达水平显著升高。外源喷施20micro;M Spd后，叶绿素a和总蛋白含量显著增加，而H2O2含量、GSH、SOD、CAT、POD、GR活性、Na/K比值、APX2、GR和SOD表达水平均下降。这些结果表明，外源施用20micro;M亚精胺能有效缓解盐胁迫对紫花苜蓿的伤害。研究结果可为紫花苜蓿栽培提供依据，促进盐碱地的开发利用。

关键词：耐盐碱、抗氧化酶、基因表达、紫花苜蓿、亚精胺

引言

紫花苜蓿(Medicago sativaL.)被认为是最重要的饲料作物之一，因为它具有很高的饲喂均匀性、固氮能力和可消化纤维含量(Ferreira等人，2015年)。中国种植紫花苜蓿已有2000多年的历史，近年来，出于畜牧业目的市场对紫花苜蓿的需求一直在逐渐增加(Li等人，2010年)。然而，考虑到几个苜蓿种植地区受到高盐分水平的影响，苜蓿植物对盐分的敏感性是一个问题(Anower等人，2013年)。事实上，盐分胁迫是全球关注的问题，并促使人们努力提高这种作物的耐盐性。

以往的研究表明，盐分胁迫引起的离子毒性和渗透胁迫抑制了植物的萌发和生长(朱2003)。此外，活性氧物种(ROS)的产生对高盐度的响应导致膜半通透性的丧失，并损害植物细胞中的核酸和蛋白质(朱等人，2014年)。为了将这些影响降到最低，植物已经发展出高效的抗氧化系统，包括低分子质量的抗氧化剂和抗氧化酶(Azooz等人，2011年)。能够清除积累的活性氧的抗氧化酶包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)和谷胱甘肽还原酶(GR)(Ahmad等人，2010年；Roychoudhurtify，2011年)。活性氧造成的损害程度取决于这些抗氧化剂清除系统对活性氧的产生和清除之间的平衡(Khan And Panda 2008)。许多研究表明，这种抗氧化酶活性与耐盐性密切相关(Koca等人，2007年；Sairam和Sriastava2002)。因此，依赖各种抗氧化剂和ROS清除剂减轻氧化损伤的程度，可以增强植物对盐分的抗性。（Raza et al.2007）。在盐分胁迫条件下，植物为了保护其细胞免受氧化损伤可以表达几种编码抗氧化酶的基因（de Car-valho等人，2013）。Li等（2013年）发现小麦幼苗在盐分胁迫下GPX1，GPX2，DHAR和GS水平升高。相反，盐胁迫降低了苜蓿的APX-1，APX-2和Cu / Zn-SOD转录水平（Wang等，2012）。 因此，对抗氧化酶基因表达的清楚理解将有助于阐明植物对盐分的分子适应性。

亚精胺[N-(-3-氨丙基)-1，4-二氨基丁烷](Spd)是高等植物中一种主要的、普遍存在的多胺(Alvarez等人，2003年)，与逆境胁迫密切相关(Du等人，2010年)。先前的研究表明，喷施Spd可以增强植物对重金属毒害(Xu等人，2011年)、渍涝(姚等人，2009年)、高温(Mostofa等人，2014年)、冷害(Yamamoto等人，2012年)、干旱(Li等人，2016年)和盐分(Sang等人，2016年)的耐性；这是因为Spd能抑制电解质或氨基酸的渗漏，并防止或减轻质膜伤害。此外，SPD还具有清除自由基的功能(Roychoudhury等人，2011年)。Saleethong等人(2011)指出，Spd的施用可以改善与盐度相关的伤害，包括叶绿素减少、膜损伤、脂质过氧化、活性氧积累和离子失衡。同样，施用Spd提高了暴露在盐分下的黄瓜幼苗的净光合速率和光系统II的实际光化学效率(Duan等人，2008)。然而，Spd缓解盐度危害的效果与Spd水平、胁迫程度和植物种类密切相关。

因此，本研究旨在研究外源Spd对盐胁迫下紫花苜蓿植株生长、抗氧化酶活性、离子平衡和基因表达的影响。这些工作加深了我们对Spd诱导的耐盐性生理基础的认识，促进了盐碱地的开发利用。

材料与方法

植物材料和处理

取自北京CloverGroup紫花苜蓿品种lsquo;Magnum Saltrsquo;，被播种在一次性塑料杯(上直径6.8 cm，下直径4.8 cm，高7.4 cm)中，内填沙子(粒径lt;1 mm)。在每个杯底共钻5个孔(直径5 mm)，以排出多余的水并保持良好的土壤曝气性。将装满的杯子(n=3)随机放入温室内，每隔2天用半强度营养液浇水。30天后，所有装有已长成的幼苗的杯子被转移到生长室中，光周期为16h，昼夜温度为25°C/20°C，相对湿度为75%，株高的量子通量密度为300mu;mol光子mminus;2sminus;1。经过4天的适应，所有紫花苜蓿幼苗都暴露在不同浓度的Spd 1%NaCl中。在初步实验中测定了NaCl水平，我们发现在该浓度下观察到了显著的表型差异。6个处理分别是：CK，单一半强度Hoagland营养液；T1，1%NaCl；T2，10mu;M Spd 1%NaCl；T3，20mu;M Spd 1%NaCl；T4，40mu;M Spd 1%NaCl；T5，60mu;M Spd 1%NaCl。将NaCl溶解在一半浓度的Hoagland营养液中，按特定浓度(每盆10mL，使用DDH2O)喷洒和浇水。其他没有施用SPD的植株用等量的ddH2O喷洒和浇水，每个处理一式三份，所有的杯子都是随机排列的。

测量

（一）生理参数

取每株植物的新鲜叶片(0.1g)，放入15mL二甲基亚砜的50mL试管中，在室温下黑暗中提取总叶绿素含量72h后，取出上清液，用分光光度计(UV-2600；UNICO Instruments，上海，中国)在663 nm和645 nm处测定其吸光度(Rasool等人，2013)。

正如Martins等人(2013)所描述的那样，使用电导率仪测量电解液泄漏(EL)。将新鲜叶片(0.1g)切下，用去离子水洗涤，去除表面附着的电解质，切成0.5 cm的片段，然后浸泡在35mL去离子水中，在室温(20-25°C)下摇动过夜。使用电导仪(Jenco-3173；JencoInstruments，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国)测量并记录溶液的初始电导率(Ci)。然后将这些样品在90°C加热30分钟，然后冷却环室温度。还测定了最终电导率(Cmax)。相对电导率的计算公式为：EL(%)=(Ci/Cmax)times;100。

为了测定H2O2和谷胱甘肽(GSH)的含量，用液氮粉碎1.0g鲜叶，并将其悬浮在9mL生理盐水中。匀浆在4°C，10000times;g离心10min，收集上清液，用H2O2检测试剂盒和GSH检测试剂盒(分别为A064-1和A006-1，南京建城生物工程研究所，南京，中国，南京)收集和分析。

（二）Na/K比值测定

新鲜的叶子在80°C下烘干至恒重，然后用砂浆研磨成粉末。子样(1.0g)称量，在370°C用H2SO4和H2O2消化，直至获得清澈的溶液。用AP1500(中国上海敖浦)火焰光度计，按Mostofa等人的方法测定钠、钾含量。(2014)；然后计算Na/K比值。

（三）总蛋白和酶测定

新鲜叶片(1.0g)用液氮研磨，悬浮在9mL生理盐水中，置于预冷的研钵和砧中，放入冰浴中。匀浆在4°C，12000times;g离心10min，收集上清液。用南京建成生物工程研究所提供的SOD、CAT、POD和GR试剂盒(A001-1)、CAT试剂盒(A007-1)、植物POD试剂盒(A084-3)和GR试剂盒(A062)测定SOD、CAT、POD和GR活性。用总蛋白分析试剂盒(A045-2，中国南京建城生物工程研究所)测定总蛋白。

  1. 基因表达(定量逆转录聚合酶链反应[RT-qPCR])

取充分展开的叶片(0.1g鲜重)提取RNA。按Hu等人的方法用Trizol试剂(Invitgen，Carlsad，CA，USA)提取总RNA(2012)。随后接受了不含核糖核酸酶的DNasel治疗。对于RTPCR，根据制造商的说明(加拿大发酵公司，伯灵顿，加拿大，加拿大)使用cDNA合成试剂盒用寡核苷酸(DT)引物从2mu;g RNA中反转录出第一链cDNA。在前人研究的基础上，合成了不同基因的引物，并用其在qPCR中扩增基因(表1)。使用Opticon Monitor软件版本2.03(MJResearch，剑桥，马萨诸塞州，美国)分析所有PCR扩增数据。

数据分析

取至少三个重复的平均值plusmn;标准差。用18.0版(SPSS Inc.，芝加哥，伊利诺伊州，美国)的SPSS对SPD对生理参数(叶绿素含量、EL、H2O2和GSH)、Na/K比值、总蛋白、酶活性(SOD、CAT、POD和GR)和基因表达的影响进行了单因素方差分析(ANOVA)。处理方法采用Fisher最小显著性差异(LSD)检验，显著性水平为0.05。

结果

总叶绿素含量与相对电导率

1%NaCl处理显著降低了叶绿素b(Chlb)和叶绿素a b的含量，虽然CK与T1的叶绿素含量差异不显著(表2)，但Spd(T2、T3、T4和T5)的施用显著缓解了叶绿素含量的降低。相反，Spd对Chlb含量的降低没有明显的缓解作用。T5处理下Chla b含量高于T1(ple;0.0 5)，T2、T3和T4处理无缓解作用。

1%NaCl处理显著提高了叶片的相对电解质渗漏率(REL)，但不同浓度的SPD处理间差异不显著(表2)。此外，与未处理的植株相比，T3、T4和T5的处理没有显著的缓解作用。

钠钾比

为了确定盐害对植物的危害，我们还测定了钠和钾的含量，发现T1的Na/K比比对照显著增加(最高可达3.40倍)(图1)。与不施Spd的处理相比，无论施盐水平如何，外源施用Spd后，盐处理植株的Na/K比值显著降低(在31.13%~51.54%之间)。然而，不同施肥量处理(T2、T3、T4和T5)之间的Na/K比值没有显著差异。值得注意的是，在T2、T3和CK处理中也检测到相似的Na/K比值。

总蛋白、过氧化氢和谷胱甘肽

与对照相比，1%NaCl处理显著降低了总蛋白含量，而喷施20、40和60 mM的Spd显著降低了总蛋白含量(表3)。由于盐分暴露，T1和T2处理的H2O2和GSH含量均高于对照。T3的H2O2含量比T1低15.78%。T1和T2的GSH含量也高于CK(分别为18.58%和17.96%)。外源Spd浓度为20mu;M(T3)和40mu;M(T4)时，谷胱甘肽含量较T1显著降低(分别为16.19%和16.71%)，但处理T3、T4、T5和CK之间的H2O2和GSH含量差异不显著。

SOD、CAT、POD和GR活性

超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GR)活性在T1处理下显著高于CK(28.99%~69.42%)，T3、T4和T5处理的SOD和GR活性低于T1，而CK、T2、T3、T4和T5处理之间差异不显著；虽然CK、T2、T3、T4和T5处理之间的CAT活性差异不显著，但T3的CAT活性低于T1。处理T3和T4的POD活性均低于T1，处理T2、T3、T4和T5之间的POD活性差异不显著。而T2、T3、T4和T5的POD活性比对照高38.25%~51.27%(表4)。

基因表达

与对照相比，紫花苜蓿APX1、APX2、GR和SOD的表达在整个盐度处理期间均上调(图2)。与处理T1、T2、T4和T5相比，处理T3的APX1在2、4和12h的表达水平较低，但差异不显著，此外，当用不同浓度的Spd处理时，APX1在暴露于1%NaCl的植物中也有相似的表达水平。

无论施药浓度如何，在1%NaCl胁迫下，SPD处理的植株在4、7和12h的APX2表达水平均低于非SPD处理的植株。但是，T2、T3、T4和T5处理之间的APX2表达水平没有显著差异。

施用Spd后，T3、T4和T5处理间GR表达水平差异不显著，

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