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介孔二氧化硅包覆的金纳米棒负载阿霉素给药系统用于化疗–光热联合治疗
摘要
由介孔二氧化硅包覆的金纳米棒负载DOX制备的给药系统，可以适用于化疗–光热联合疗法，其疗效一直通过体外测试和体内测试来证实。所制备的纳米粒子，利用透射电子显微镜（TEM），紫外–可见吸收光谱和zeta电位等进行表征，呈现出高的阿霉素装载能力以及pH敏感释放特性。
通过在模拟体液中进行几个重复的近红外照射剂量测试，发现pGNRs@mSiO2-DOX 的光热转换特性是稳定的。体外实验结果表明，与DOX相比，pGNRs@mSiO2-DOX可以对乳腺癌MCF-7细胞造成显著的损害。与此相反，与单纯的DOX和CTAB包裹GNRs相比，pGNRs@mSiO2-DOX对人羊膜细胞造成更低的毒性。体内实验结果显示，静脉注射pGNRs@mSiO2-DOX (1.7 mg/kg)可以显著抑制雌性BALB小鼠皮下埃利希癌生长（P＜0.0001）。与此一致的是，组织病理学检查发现了接受联合治疗的小鼠肿瘤细胞减小这个细节。基于所获得的结果，这种被动靶向的pGNRs@mSiO2-DOX可以有效地载药，以及在肿瘤部位产生热量，来达到高的联合治疗效果。
背景介绍
在过去的几十年中，对贵金属纳米粒子进行了广泛研究，因为它们在许多领域具有很高的潜在应用价值，尤其是在医疗和诊断领域。由于贵金属内在的低毒特性和由等离子体共振导致的增强光学特性。最近，由于金纳米等离子体共振特性，大量的研究集中于金纳米棒用于肿瘤治疗。然而，传统用于覆盖于金纳米棒表面的十六烷基溴化甲基铵，会对人体细胞造成显著的毒性。
此外，CTAB诱导GNRs聚集，这会导致损失其独特的光学性能，减少细胞对GNRs的摄取。因此CTAB覆盖GNRs表面，阻碍了其在生物医学中的应用。另一方面，由于介孔二氧化硅具有高的载药能力，无生物毒性以及生物可降解等特性，因此介孔二氧化硅是一种很适合包裹GNRs的材料。此外，介孔二氧化硅已经广泛应用于生物载体材料，例如抗癌药物，DNA,以及蛋白质。同时，介孔二氧化硅具有大的表面积，可以改变的尺寸，高的介孔容量，表面良好的可改造性。它们的特点是具有酸敏感特性，在酸性肿瘤环境中具有高的释药量。
在这项研究中，我们研究了多功能纳米粒子的制备方法（pGNRs@mSiO2-DOX)，可适用于化疗–光热联合治疗癌症。
对这些纳米颗粒进行了载化疗药物DOX后的在肿瘤部位的pH敏感性测试，以及它们独特的近红外光诱导热疗。同时，在缓冲液中，以及在模拟体液溶液对这些纳米粒子的物理和化学性质进行了研究。通过在体内和体外的使用单一剂量低浓度的DOX，来研究所制备的pGNRs@mSiO2- DOX给药系统的治疗指数，目的是为了降低药物对重要组织的毒性。
2.材料和方法
阿霉素（DOX）、氯金酸（HAuCl4.3H2O），十六烷基四甲基溴化铵（CTAB）、正硅酸乙酯（TEOS）和抗坏血酸（AA），均购自Sigma–Aldrich公司。硝酸银（AgNO3），(CH2OH)3CNH2缓冲液和硼氢化钠（NaBH4）购自默克。氢氧化铵（NH4OH，28%）购自Fluka公司。
2.1 pGNRs@mSiO2-DOX的制备
2.1.1 GNRs的制备
根据先前报道的银离子辅助生成种子并且以CTAB为模板的方法来制备金纳米棒。简单来说，1.5ml，0.1mol/l的CTAB溶液，混合加入100ml,0.02mol/lHAuCl4。然后，加入100ml,0.01mol/l冰的的NaBH4溶液，接着形成了棕黄色的溶液。混合液快速搅拌2分钟，然后放置在25度的水浴中，恒温保持2小时。
金纳米棒的生长溶液的制备：将30ml，0.1mol/l的CTAB加入到1.5ml，02mol/l HAuCl4和1.0ml，0.01mol/l的AgNO3混合溶液中。然后加入0.8ml，0.08mol/l的抗坏血酸溶液，混合溶液的颜色由深黄色变为无色，透明液体。接着将70ml的种子溶液加入到生长溶液中，保持温度为25度，溶液的颜色逐渐改变，最终变成了紫色。所获得的GNRs为4472g，离心30分钟（sigma202, 冷藏-离心；德国）。用去离子水洗所得颗粒2遍，来去除过量的CTAB.最后将其分散40ml去离子水中。
2.1.2 GNRs@mSiO2的制备
本文通过改进的Stober方法来制备介孔二氧化硅。简单来说，将50ml的氨水溶液加入到GNRs溶液中，来调节Ph为10，然后加入10.5ml,10mmol/l的TEOS/乙醇溶液，速率为3.5ml/h,混合溶液在40度恒温下搅拌24小时。对合成的产品GNRs@mSiO2进行离心操作，分别用去离子水和乙醇溶液洗涤几次。将合成的GNRs@mSiO2纳米颗粒分散到含有120毫升氯化氢的乙醇溶液（60毫升）中，在30度条件下搅拌3小时，来去除CTAB。去除表面的CTAB的操作重复两次，来确保完全去除CTAB。然后将样品离心，用去离子水洗涤三次，为了去除氯化氢和氨，通过测量样品在805nm的光吸收情况来调整样品的浓度。
2.1.3 GNRs@mSiO2-DOX的制备
将2毫升的GNRs @ mSiO2纳米粒子加入到pH值为8的250毫克盐酸阿霉素（DOX）中。混合物在室温下搅拌24小时，GNRs @ mSiO2- DOX然后在4472 g离心30分钟，将纳米颗粒用PBS洗涤多次。根据DOX含量从校准曲线，在480nm激光照射下的释药强度，以及585nm激光照射下的释药强度，可以确定DOX在上清液中的含量（荧光分光光度计（岛津、射频5301pc，日本）。载药效率可以根据下面的公式计算：
2.1.4 GNRs@mSiO2表面覆盖聚乙二醇
GNRs@mSiO2-DOX表面包裹聚乙二醇，用于静脉注射，通过在每毫升GNRs@mSiO2-DOX溶液中加入10毫升，25mmol/l的PEG-SH溶液，在4度恒温下静置12小时。对混悬液进行离心操作，离心30分钟，从溶液中除去PEG-SH。在pGNRs@mSiO2-DOX用于体内研究时，先将pGNRs@mSiO2-DOX纳米粒保存在0.9%的盐溶液中。
2.2样品特性
使用工作在200千伏的透射电子显微镜（TEM）测定GNRs和GNRs@mSiO2的形态和大小。使用UV–可见分光光度计(Jenway UV-6420; Barloworld Scientific, Essex, UK），在波长范围为400–900 nm的吸收光谱，测量。此外，GNRs和pGNRs@mSiO2的Zeta电位测量，将其溶解早去离子水中，然后使用动态光散射仪（Zeta电位/粒度仪nicomptm 380 ZLS，美国）进行测量。
2.3 pGNRs@mSiO2-DOX的释放响应测试
使用截留分子量为12,000 Da的消毒透析膜（纤维素透析管，美国）来进行药物释药性试。分别使用Ph为7.4和5.6的缓冲溶液做为药物释放性试验的媒介，来模仿正常组织细胞和癌细胞的生理环境。所用的透析袋在释放介质中浸泡过夜。1毫升的pGNRs@mSiO2-DOX (190 mg/ml)（190毫克/毫升），经过离心后颗粒分散在1毫升的释放介质，然后放入透析袋。密封的透析袋被放置到棕色玻璃瓶，然后将20毫升的释放介质添加到每个瓶子。在37度避光密封条件下，以105转每分钟的速度，摇动这些瓶子。在连续的时间间隔内，通过荧光光度分析法，测量3毫升的释放介质释放药物的浓度。然后将其重新溶解在最初的释放介质中。释药浓度由480nm和585nm光照射下的校正曲线测定。
2.4 pGNRs@mSiO2-DOX的体内毒性试验
将乳腺癌细胞系MCF-7培养在含10%胎牛血清的RPMI 1640中。这些细胞被人供养在37度，含5%二氧化碳的湿润孵化器。在所有的实验中， 用含0.25%胰蛋白酶EDTA新鲜培养基培养细胞。在体外的细胞毒性对MCF-7细胞的测定采用WST-1细胞增殖实验。乳腺癌MCF-7细胞接种于96孔密度为100细胞/孔板（100毫升的溶液中）。在37度100毫升含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养24小时后，50毫升的培养基被丢弃，然后用不同浓度的阿霉素以及pGNRs@mSiO2-DOX替换。在不同浓度pGNRs@mSiO2-DOX培养下，细胞孵化24小时，然后细胞暴露于近红外激光60分钟。后处理后，威尔斯的数字显微图像被使用一个倒置光学显微镜的放大20倍。细胞生存能力就算作药物浓度的函数。
人类羊膜细胞系被种到96孔板，密度为55000细胞每板。37度，在200毫升的RPMI 1640 含有10%的FBS，孵化24小时后，50毫升培养基被丢弃，分别用50 ml的CTAB包裹的GNRs, pGNRs@mSiO2-DOX (DOX 浓度190 mg/ml) ，以及浓度为120 mg/ml的DOX处理细胞。细胞孵化24小时后，将10毫升WST-1溶剂添加到每个细胞培养板中。再将这些细胞孵化4 小时，监测用450 nm Elisa micro-plate TECAN)检测吸光度。没有纳米颗粒培养基作为空白对比组，细胞毒性通过细胞生存能力与空白实验的百分比来进行测试。
2.5肿瘤细胞接种小鼠
埃利希腹水瘤被选为一个快速增长的实验性肿瘤模型，各种实验设计的抗癌药物可以应用。来自国家癌症研究所的“NCI”,开罗大学得到了埃利希腹水癌细胞和腹腔注射到雌性BALB小鼠。7天注射后收集腹水。埃利希细胞洗涤两次，然后放在5毫升生理盐水中悬浮液。雌性BALB小鼠（20–25克，6–8周龄）从NCI动物房得到在其两侧皮下注射，其中肿瘤细胞已发展成一个单一的固体形态。肿瘤生长监测接种后所需体积约为0.3–0.6 cm3。通过使用的指导方针的照顾和使用的实验室动物，该程序已经经过在开罗大学动物伦理委员会的批准。
2.6在体内近红外激光的光热治疗
在这项研究中，六十只小鼠分为四组：A,B,C,D。通过腹腔注射麻醉小鼠注射用硫喷妥钠（48毫克/公斤）。A组小鼠静脉注射200毫升的pGNRs@mSiO2-DOX（相当于阿霉素1.7毫克/公斤体重）经尾静脉。24小时后，暴露肿瘤体外的近红外激光60分钟，B组小鼠经尾静脉注射阿霉素（40毫升相当于4毫克/公斤体重，DOX），这是用于人类治疗典型的常规治疗剂量。C组（阳性对照）分别静脉注射pH 为7.4的200 ml PBS，A组进行相同的处理。组A和组C肿瘤部位的皮肤，进行最大程度的剃光，来达到最大化辐射的目的。对照D组小鼠（阴性对照组）既不接受注射也不接受激光照射。
2.7肿瘤大小的测量
Ehrlich肿瘤模型的特点是它的高增长率,每隔三天测量肿瘤体积的变化(DV)，一共四组(a,B,C和D)，测量十八天。椭圆形肿瘤体积(V)是使用公式计算V =(d2D),D和d分别是长轴和短轴,分别使用数显卡尺测量。
使用费舍尔的LSD(最小意义差)多功能相关测试来统计评价肿瘤大小。假定值小于0.05，一般认为是具有统计学意义的。每个数据点是平均值呈现的—至少为测量7~10次得标准误差（SE）。此外，SPSS版本17用于统计分析。
2.8 组织病理学检查
治疗组A和组C激光照射后，立即死亡,然后可确定肿瘤细胞的坏死比例。肿瘤被切除,放置在10%中性福尔马林中，固定嵌入在石蜡，然后分段。治疗后直接得到组织部分，然后用苏木精和伊红染色后。对组B(三天后注射)对照组D进行前面相同的处理，组织部分都是使用光学显微镜检查(CX31奥林巴斯显微镜)连接数码相机(佳能)进行观察。
3.结果与讨论
所制备的CTAB包裹GNRs以及GNRs@mSiO4的大小和形状使用TEM图像进行测量，分别如图1 a和b所示。GNRs的平均长度和宽度分别为 40纳米和10纳米,长度和宽度分别相当于3000 nm
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