英语原文共 8 页，剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料
乙醇注入法制备红景天苷纳米脂质体及其体外释放研究
摘要：本文的目的是通过乙醇注入法制备红景天苷纳米脂质体。为了使纳米脂质体有较高的红景天苷包封率，对红景天苷的投料量，胆固醇，吐温80，离子强度和研究脂质浓度等几个因素进行了研究，以得到最佳的处方。实验得到较高的包封率是45%，处方为：胆固醇与脂质的质量比为1:4，吐温80和脂质的摩尔比为1:2，离子强度范围在20〜50 mmol / L。通过优化方案，纳米脂质体的粒径低于100nm，Zeta电位范围在（-15plusmn;5 ）mV。制得的红景天苷纳米脂质体在体外释放研究结果中使释放时间延长至24小时。
关键词：纳米脂质体 红景天苷 包封率 乙醇注射法 体外释放
引言
高山红景天是一种典型的传统中国草药，近几十年来一直被学者广泛研究。红景天苷可以提高机体对各种化学、生物和物理因子的抵抗力，因此，它已被俄罗斯研究人员用作一种适应原。有研究结果表明，红景天的两个主要生物活性成分——红景天苷和苷元酪醇具有抗缺氧、抗疲劳和抗微波辐射的功能。据报道，在二十世纪晚期，红景天苷专门用于宇航员、飞行员、登山者和潜水员，以提高他们在恶劣环境中的生存能力。然而，目前开发的含有红景天苷的功能性食品还存在一些缺点，如血液浓度不稳定，生物利用度低，摄入频率太高等。
自20世纪60年代以来，以各种磷脂为原料制备脂质体已经被广泛地研究。亲水性化合物通过包裹在水相中或者嵌入疏水性化合物中疏水域的的方式，能够被磷脂所携带。在生物相容性，可目标性，可控制释放，以及可以在不同的粒径大小范围制备等方面，脂质体有很大的优势。20世纪70年代，研究人员已经认识到脂质体很可能是有效的药物输送介质。迄今，制备脂质体已经有很多不同的方法如薄膜分散法，冻融法，反相蒸发法和超声处理法等。然而，为了避免食品中残留有害溶剂，不允许食品中存在有机溶剂，导致这些制备方法在工业生产的应用方面还存在很多不足。
当脂质体用作食物中功能化合物的载体时，制备过程中必须尽可能地避免使用有机溶剂。但是，因为食品工业中允许有限量的乙醇存在，故乙醇注射法制备脂质体是可行的。关于脂质体中药物的包封问题，乙醇注入法也有一些缺点。这主要是由于使用的体积比较大，亲水性物质亲和力比较低引起的。但是，乙醇注入法的优点是操作简便易行，同时避免了潜在的有害的化学和物理处理，这对于按比例增加非常简单，并且也有助于建立大规模应用的生产方法。
基于上述原因，本文的目的是优化乙醇注入法，使之适合批量制备红景天苷纳米脂质体。对影响纳米脂质体包封率的因素如红景天苷的投料量、胆固醇、吐温80、离子强度和脂质浓度等。另外，还进行了红景天苷纳米脂质体的体外释放研究。
材料和方法
材料
蛋黄卵磷脂（PC，纯度85％）；胆固醇（国药化学试剂有限公司，中国上海）；吐温80（国药化学试剂有限公司中国上海）；红景天苷标准品（国家控制研究所，医药生物制品，中国北京）；高山红景天（人参工厂，中国吉林省）；DA 201-C非离子型聚合物吸附剂（南开大学获得化学有限公司，中国天津）；聚酰胺粉（东泰化工有限公司，中国浙江）。所有试剂均为分析纯。
离心机；
红景天苷的提取和分离
根据固体和液体的比例为1:25（g / mL），将原料用乙醇（体积比乙醇:水为20:80）浸泡。再将混合物在由FISO微波工作站改良的微波炉（MWS-8，FISO公司，加拿大）中照射120s，微波辐射功率设置为130W。混合物过滤真空。减压除去萃取液中残留的乙醇。程序重复两次。将红景天苷提取物用去离子水以体积比1:5稀释，离心（8,000rpm，10min）（Sigma 有限公司，德国），收集澄清的上清液。
红景天苷用DA 201-C（直径2.6cm，长度30cm）分离。在DA 201-C柱中，用去离子水和30％乙醇溶液（体积比，乙醇:水30:70）将多糖、蛋白质、鞣质、黏胶和极性色素等物质从红景天苷提取物洗脱。残留在柱中的红景天苷用50％乙醇（体积比，乙醇:水为50:50）提取。然后蒸发溶剂，将红景天苷提取物溶解于适量的去离子水中。之后，将红景天苷提取物加入到聚酰胺柱（直径2cm，长度50cm），并用去离子水洗脱。红景天苷的含量馏分浓缩后，红景天苷的纯度为30％，总酚含量超过95％。
纳米脂质体的制备
根据Lasic，脂质体制备方法如下：用磷酸盐缓冲液（0.05mol / L，pH7.0）将部分纯化的红景天苷浓缩物的浓度调节至1mg / mL；将适量的吐温80加入到上述红景天苷溶液中并加热至60℃，剧烈搅拌。将PC的脂质混合物和胆固醇溶解于大约60 ℃的无水乙醇中，并快速注入到上述充分搅拌的水相里，保持半小时。由于脂质体的形成，水相立即变成乳白色。之后，转移脂质体系至100mL圆底烧瓶。烧瓶连接到旋转蒸发器，温度降至40℃，水浴。水合反应期间，减压除去乙醇。获得的脂质体用探测超声波（超音速＆材料振动单元，400W，20kHz，UK）处理1分钟（50％的振幅强度，1秒脉冲开启和1秒脉冲关断）。
测定红景天苷含量及包封率的测定
用比色法测定红景天苷的含量。通过紫外/可见分光光度计检测，最大吸收波长在480nm处，可获得红景天苷标准曲线的线性方程为：
通过透析技术确定脂质中体游离的红景天苷含量来测定脂质体的包封效率。 精密称取1ml红景天苷脂质体置于纤维素膜透析袋中，并将透析袋（MW cut-off 12,000, Shanghai Huamei Biochemistry Ltd., Shanghai, China）于100mL磷酸盐缓冲液（pH7.0,0.05mol /L）中浸泡8小时，温和搅拌。透析后的脂质体用5 mL 10％Triton X-100溶解，得到澄清溶液。所得溶液中红景天苷的含量根据上述测定游离红景天苷的方法确。
包封率百分比的计算公式如下：
Zeta电位的测量
通过zeta电位仪2000测量纳米脂质体的激光多普勒电泳迁移率来测得纳米脂质体的Zeta电位，温度为25plusmn;0.1℃。 所有样品重复测定三次。
脂质体粒径大小测量
使用动态光散射技术来测量纳米脂质体的粒径分布，在25℃时激光的强度以90°的角度被检测样品分散。将脂质体分散体（0.1mL）用磷酸盐缓冲液（4 mL）稀释，以避免由于粒子间的相互作用而产生的多次散射现象。每个样品进行至少十次运行。水的粘度值（0.8872mPa·s）和折射率（1.33）用于所有的测量。纳米脂质体的平均直径和多分散指数由仪器累积分析，自动提供。
浊度测量
浊度量化由颗粒悬浮散射光的程度确定。它主要取决于存在于液相中的胶体的大小，颗粒与介质之间的折射率差异和粒度分布。要获得纳米脂质体粒径变化的定性测量，需要根据Xia等人报道的程序测量稀释的脂质体系统的浊度。1mL红景天苷纳米脂质体悬浮液用2mL磷酸盐缓冲液（0.05mol / L，pH7.0）精确稀释，在室温下保持30分钟。然后使用石英测量该系统1cm的光程长度，检测波长为600nm。样品量为3 mL，所有的分光光度分析进行三份，取平均值。
体外释放研究
红景天苷从纳米脂质体中体外释放通过使用改良的膜扩散技术。将1mL红景天苷纳米脂质体分散悬浮于0.5mL人工胃液（SGF）或人工肠液（SIF）中，然后转移到透析袋（截止12000MW）。 SGF由氯化钠（2.0g / L），氯化钾（0.82g / L），盐酸37％（7mL），尿素（0.085g /L），牛血清白蛋白（1.0g / L）和胃蛋白酶（1.0g / L）组成，用盐酸调节pH为1.2。SGF用0.45mu;m的过滤器过滤灭菌。 SIF由氢氧化钠（0.82g / L），磷酸二氢化钾（9.07g / L），尿素（0.075g / L），牛血清白蛋白（1.0g / L），猪胰腺脂肪酶（0.375g /L）和胆汁盐（1.5g / L）组成，pH值调为6.8。将透析袋悬浮在含有50 mL SGF或SIF的烧瓶中，将烧瓶置于振动筛中，在37℃下慢慢摇动。在预定的时间采集1 mL透析液样品，并立即补充具有相同体积的新鲜的SGF或SIF。取出的样品进行红景天苷含量分析。在实验结束时，将0.5mL Triton-100加入透析袋中以破坏脂质体层。对透析液的等分试样进行了抽样确定对应于100％释放的浓度。用同样的方法研究游离红景天苷溶液的释放。
统计分析
数据通过单因素方差分析（ANOVA）进行比较，样本平均值之间的差异通过最小二乘差分法进行分析（alpha;= 0.05）。
结果与讨论
载药能力和脂质浓度的影响
红景天苷装载能力对红景天苷纳米脂质体包封率的影响可以通过在保持脂质相水平的同时加入红景天苷的量的变化来测定。纳米脂质体表现出良好的包封能力（图1）。随着红景天苷装载量的增加，被包封在纳米脂质体中的红景天苷的比例呈上升趋势，而且，当红景天苷的载药能力为5％（w / w）的脂质相时，被包封率约达45％。但红景天苷加载能力超过5％，EE的价值便会下降。这个结果与Hao等人发现的脂质浓度对囊泡包封效率的影响相似。它可能表明在一个系统中，固定的脂质产生固定量的纳米脂质体。一定量的脂质体具有有限的包封能力，这是导致当红景天苷浓度太高时，封装效率降低的原因。理论上，包封率应该随着脂溶性药物中脂质浓度的增加而增加。但这并不适用于水溶性药物。应该强调的是，红景天苷结构中有一个羟基苯的结构。由于这个极性基团在红景天苷分子与脂质的极性端之间的影响，脂质双分子层与红景天苷的相容性得到了提高。这使得红景天苷分子很容易地被包封在水相内部。
图2 的结果表明，脂质的浓度太高或者太低都会导致红景天苷纳米脂质体的包封率下降。脂质体分散体的最终浓度取决于制备过程中所用的水化体积。水化体积太大，会使得脂质和红景天苷的浓度变小，这可能会使得红景天苷难以被检测到。另外，实验结果显示，脂质的浓度越高，多分散指数就越高。这表明，脂质浓度太高，所得到的纳米脂质体的粒径会越大，而且会分布不均。考虑到包封率和多分散性，选择脂质浓度为1%（w/w）进行下一步研究。
根据图1和图2所示的结果，红景天苷的包封率都比较高，包封效果不错。这与红景天苷提取物的水溶性高有很大关系。一般来说，认为药物在正辛醇和水的表观分配系数（P值）是衡量药物包封于脂质体中难易程度的指标。水溶性（Log P lt;-0.3）或脂溶性（Log Pgt; 4.5）药物都可以成功地包封在脂质体中，并表现出稳定的物理化学性质。根据Gu的报道，在pH 7.4时，红景天苷提取物的Log P为 - 0.747， 。在我们的实验中，当pH 为3.0-7.0时，LogP值的测定范围为0.05至 - 1.47。实验结果之间的差别可能是由于提取过程的微小差异是造成的。红景天苷溶液的pH约为6.8，Log P为-1.05，大大低于-0.3。结果表明沙利度苷被成功包埋于脂质体内部。
胆固醇对包封率和粒径的影响
不同质量比的胆固醇和脂质组成的纳米脂质体的研究描述了胆固醇对封装能力的影响程度（见图3）。所有脂质体系都添加了相同量的红景天苷。在胆固醇水平低的时候，包封率比较高。随着胆固醇含量的增加，包封率从45％降至36％，32％（P lt;0.05）。包封率的升高可能是因为水化期间脂质体膜的稳定性增加，而脂质体膜的稳定性增加是因为刚性增加和胆固醇渗透性的降低。一致认为，胆固醇是凝胶相的晶体破坏剂，也是在流动相中没有整体阶段僵化时链状排序的诱导剂。但胆固醇用量超过一定的水平就会开始破坏双层结构导致被包的溶质分子的损失。此外，观察到在脂质体分散体中胆固醇与脂质的质量比为0.75时，会发生相分离。制备纳米脂质体的过程中必须避免这种有害的结果。
对于水溶性化合物，包封率极大地依赖于在囊泡的内容积。内囊体积的改进可以相应地提高包封效率。在我们的工作中，包封率的增加可归因于胆固醇、双层膜中的缝隙空间，进而增强纳米脂质体中的红景天苷水平。胆固醇含量对红景天苷纳米脂质体粒径的影响如表1所示。纳米脂质体的颗粒大小和粒径分布有明显的变化。随着胆固醇含量的增加，红景天苷纳米脂质体的粒径从54,56到71-102nm增加依次。随着胆固醇含量的增加，纳米脂质体的粒径分布较窄（多分散性指数较低），即脂质体粒径表现出良好的均匀性。但是胆固醇用量超过一定水平（例如，胆固醇和脂质的质量比为75：100），脂质体悬浮液有最高的多分散性值0.339。这是由于双层结构遭到破坏的原因。因此，适当比例的胆固醇和脂质是非常重要的，它可以在保证纳米脂质体稳定性的的前提下，使包封率最大化。
吐温80的影响
许多实验显示静脉内给药，纳米脂质体可以快速释放包封或膜结合分子。 用聚合物如聚山梨酯表面活性剂（吐温），聚乙二醇和聚乙烯醇制备的纳米脂质体（商业上称作隐形），空间稳定，可以维持纳米脂质体在体内循环有缓慢的代谢和吸收。一般认为纳米脂质体稳定性的提高是由于表面附着的聚合物，其代表了相互作用的大分子的空间位阻。在这个研究中，进行了红景天苷纳米脂质体加入不同量吐温80的调查。
如图4所示，随着吐温80 浓度的增加，包封率从20%增长到43%。原因可能是脂质体表面致密化增加了亲脂性环境的可用性，使得容纳红景天苷
剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料
资料编号：[137461]，资料为PDF文档或Word文档，PDF文档可免费转换为Word
以上是毕业论文外文翻译，课题毕业论文、任务书、文献综述、开题报告、程序设计、图纸设计等资料可联系客服协助查找。
