受体介导的胞外多糖感知控制细菌感染外文翻译资料

 2023-01-03 12:30:59

受体介导的胞外多糖感知控制细菌感染

Y. Kawaharada1,2, S. Kelly1,2,3, M. Wibroe Nielsen1,2, C. T. Hjuler1,4, K. Gysel1,2, A. Muszynacute; ski5, R.W.Carlson5, M. B. Thygesen1,4, N. Sandal1,2, M. H. Asmussen1,2, M. Vinther1,2, S.U.Andersen1,2, L.Krusell1,2, S. Thirup1,2, K. J. Jensen1,4, C. W. Ronson1,3, M. Blaise1,2, S. Radutoiu1,2 amp; J. Stougaard1,2

表面多糖对细菌与多细胞生物体的相互作用是重要的，并且一些是病原体中的毒力因子。在豆科植物根瘤菌共生体中，细菌胞外多糖（EPS）对感染根瘤的发展至关重要。我们已经在荷花japonicus Epr3中鉴定了编码受体样激酶的基因，该受体样激酶控制了这种感染。我们显示epr3突变体在纯化EPS的感知上是有缺陷的，并且EPR3直接结合EPS并在细菌竞争研究中区分兼容性和不兼容性EPS。 Epr3在敏感根区的表皮细胞中的表达表明该蛋白参与细菌侵入，而根瘤菌和植物突变体研究表明Epr3调节细菌通过植物的表皮细胞层。最后，我们显示Epr3表达是可诱导的并且取决于宿主对细菌结瘤（Nod）因子的感知。因此植物细菌相容性和豆类根部的细菌通路受到Nod因子和EPS信号序列受体介导的识别的两阶段机制的调节。

细菌在其表面展示各种聚糖。荚膜多糖，脂多糖，环葡聚糖和胞外多糖（EPS）形成适应性动态界面，例如涉及细胞间相互作用，免疫逃避，发病机理，生物膜形成和生态位的定殖等如肠腔和上皮表面1-3。在豆科植物根瘤菌共生体系中，根瘤菌的突变分析揭示了多糖在植物固氮根瘤细胞的慢性细胞内感染中的作用4-6。接种根瘤菌的豆科植物从根瘤细胞的新细胞分裂中形成结节原基，以响应由根瘤菌产生的Nod因子，同时细菌感染过程靶向这些原初6-8。大多数豆科植物的感染，包括豆科植物莲花（Lotus japonicus），当细菌被卷曲的根毛包裹并分裂形成小菌落时，就会发生感染。植物质膜的局部细胞壁水解和内陷导致形成感染细菌，细菌繁殖9,10。这些管状结构继续通过表皮细胞层进入根皮层，然后在下面的根瘤原基分枝。最后，根瘤菌在胞吞过程中被释放到植物细胞中，并维持在被称为共生体的膜分隔的组织中。

在这种感染过程中细菌EPS的作用已经在苜蓿中华根瘤菌和豆科根瘤菌豌豆共生菌中得到最广泛的研究。 S. meli-loti和R. leguminosarum的EPS生物合成缺陷突变体的启动或延长感染线的能力严重受损[11,12]。 S. meliloti succinoglycan的八糖三聚体具有共生活性13。然而，由根瘤菌产生的EPS的组成和结构在菌株之间不同，暗示了在宿主-根瘤菌相互作用中的专门功能。已报道了亚单位骨架的单糖组成和聚合度的变化14。举例说明这种变异，一些苜蓿中华根瘤菌菌株产生琥珀酰聚糖15,16和半乳糖葡聚糖17，而豆科植物乳酸杆菌EPS是含有葡萄糖醛酸18的装饰性八聚体的聚合物。菌株特异性修饰包括非碳水化合物取代基，如O-乙酰基，丙酮酰基和琥珀酰基14。说明这些变异的重要性，生产缺乏琥珀酰基团的EPS的S. meliloti突变体表现出感染-螺纹形成受损12。

根瘤菌EPS的确切功能和感染过程中结构变化的作用仍未得到解决。已经提出了信号在改善植物防御反应中的积极作用，如防止纤维素介导的聚集21，螯合钙离子以及防止可变渗透条件或针对宿主来源的反应性氧物种。 我们通过询问植物是否在控制豆科植物-根瘤菌兼容性的受体介导过程中直接感知EPS来解决EPS功能的问题。 在这里我们显示，豆科宿主植物监测感染开始时由根瘤菌分泌EPS的结构，我们确定LysM丝氨酸/苏氨酸受体激酶中心到这种新型非自我检测机制。

EPR3胞外多糖受体

野生型Mesorhizobium loti菌株R7A（R7A）合成并分泌引起粘液菌落生长的O-乙酰化酸性EPS。 相反，该菌株的R7AexoU突变体在exoU葡糖基转移酶基因中分泌五聚糖（截短的EPS;图1a）并且具有粗糙的菌落外观。当接种到生态型岐阜的野生型莲花植物上时，与由R7A诱导的感染的成熟结节相比，R7AexoU几乎没有感染根部根瘤原基（图1c，f）（图1b，e）。 这种独特的表型为旨在鉴定参与对细菌EPS响应的植物基因的抑制突变筛选提供了明确的基线。 分离出发育成熟结节的抑制线exo277（图1d），和随后用组成型表达DsRed报道基因的R7AexoU接种子代植物揭示了感染结节的中间频率（扩展数据表1）。 完全发育的粉红色和大型白色结节形成的数量大致相同（图1g-i）。 与小的白色“颠簸”形成对比，这些结节被感染 - 如通过DsRed荧光检测到的。 为了鉴定致病基因，将隐性exo277基因座遗传定位于染色体2上包含LysM受体样激酶基因Lys3的区域（扩展数据图1a）。 随后对来自exo277的Lys3测序鉴定出将Pro改变为Leu的单核苷酸突变（CCC至CTC）在相应蛋白的LysM3结构域中（扩展数据图1b和2a）。 根据下面提供的功能特征，我们将Lys3更名为Epr3（胞外多糖受体3），将exo277等位基因更名为epr3-10。 为了证实基因鉴定，用R7AexoU DsRed菌株（补充表1）对一组TILLING等位基因进行表型分型。 两个等位基因，epr3-3和epr3-9，与epr3-10相似，具有中等频率的感染结节（扩展数据表1）。 单核苷酸置换（TGT至TAT）将EPR3胞外域的一个CxC半胱氨酸对中的半胱氨酸改变为epr3-3中的酪氨酸（扩展数据图2a）。 在epr3-9中，外显子8的边界处的剪接位点突变（G至A）导致异常剪接（补充表1）。 从LORE1反转录转座子突变体资源中分离出额外的等位基因epr3-11，epr3-12和epr3-13，分别在外显子1,2和3中携带插入序列（扩展数据图1b，扩展数据表1和补充表1）。 在epr3-11中未检测到Epr3表达的上调（扩展数据图3a），因此选择epr3-11作为与epr3-10一起的进一步表型特征的推定等位基因。

Epr3由10个外显子组成，编码约70 kDa的蛋白质。 信号肽和三个LysM基序预计在氨基末端。 羧基末端含有丝氨酸/苏氨酸激酶中保守的基序。 在这些区域之间，单程跨膜区段提示胞外激酶具有LysM基序和细胞内激酶的拓扑结构（图2a和扩展数据图2b）。 支持该烟草烟叶中eYFP标记的EPR3蛋白的预测瞬时表达将蛋白定位于质膜（Extended Data Fig.4a-c）。 系统发生学上EPR3属于日本血吸虫的17个成员LysM受体激酶家族中的Nod因子受体1（NFR1）蛋白分支。 然而，LysM2和LysM3都有分歧（扩展数据图5），并且EPR3在胞外域基序的组织中是独特的。 毗邻所有17个受体的LysM结构域的CxC标签紧邻EPR3中的LysM1和LysM2之后（图2b和扩展数据图2a，b）。 与具有特征性b1a1a2b2结构的CERK1几丁质受体和NFR1的LysM结构域相比，分别针对EPR3 LysM1和LysM2预测了b1a2b2和b1a1b2构型。 同样，参与CERK1的LysM2几丁质结合位点的基序和与几丁质的N-乙酰基相互作用的残基在EPR3中不是保守的，而是在NFR1的LysM2中可辨别的（图2b）。 在双子叶植物和单子叶植物中发现具有类似CxC基序排列的LysM受体激酶，alpha;-螺旋预测和EPR3-10的LysM3中Pro取代的保守性（Extended Data图2a，b）。

图1 | epr3抑制突变体的表型。 a，单体EPS的建议结构（每个单体的平均三个O-乙酰基（OAc）基团）。

虚线表示R7AexoU截短的EPS。 Glcp，葡萄糖; Galp，半乳糖; RibfA，riburonic酸。 b，R7A接种岐阜的代表。 c，两只R7AexoU接种的岐阜。 d，三只R7AexoU接种的exo277 / epr3-10。

e，代表R7A感染的岐阜结节。 f，岐阜县小白色R7AexoU诱导的原基。 g-1，R7AexoU接种的标本，epr3-10（i）上感染的结节（g，h）和大的感染的白色结节的代表性实例。 b-g，红色和白色箭头标记感染和未感染的结节。

j，epr3-10的细长感染线程。 k，裂纹epr3-10结节入口。

l，关闭感染口袋（用星号表示）。 比例尺：

b-d，1厘米; e-i，20毫米; j-l，50毫米。 在扩展数据表1中提供了与代表性图像有关的n个值。

EPR3控制表皮的感染

epr3突变体中结节原基的R7AexoU感染增加提示了截短的EPS和EPR3在调控细菌中的作用穿过表皮细胞层进入。 因此，我们记录了到达表皮 - 皮质细胞边界（长感染线;图1j和3a，b）和/或未到达表皮 - 皮层细胞边界的感染线（短感染线;图3a，c）接种后10和14天（dpi）。 用R7AexoU接种岐阜导致总感染线程比R7A减少五到十倍，并且在10dpi时没有感染线程到达根毛细胞的基部（图3a）。 在epr3-10和epr3-11中，由R7AexoU引发的感染线程增加并且观察到进展（图3a）。 在10和14dpi时，显着更长的感染线已经达到epr3-10的皮质边界，并且在14dpi时，epr3-10和epr3-11中感染线的总数显着更高（图3a）。 对epr3-10和epr3-11的R7AexoU感染结节的进一步显微镜检查揭示了裂缝进入的另一种感染（图1k，1）。 这些观察结果提示Epr3在调控感染中起作用，而不是在细胞分裂和原基形成所需的结节器官形成途径中。 这通过在snf1har1和snf2har1双重突变体中缺乏R7AexoU感染得到进一步证实，所述突变体由于器官发生途径的自体激活而产生过量的自发结节。 因此，宿主器官发生途径本身的激活不能挽救R7AexoU感染缺陷（扩展数据表2a）。 我们的结论是EPR3受体发挥控制感染的主要功能，无论是通过细胞内通过感染线或细胞间通路裂缝进入。 在epr3突变体中，这种控制是有缺陷的，并且R7AexoU能够启动更多的感染线程以及裂纹条目，即使在下面描述的EPR3的积极作用不存在的情况下（图3a）。

抑制表型提示了截短的EPS和EPR3之间的配体 - 受体关系。 然而，野生型EPS作为EPR3配体的功能尚不清楚。 因此比较了受体失活的后果和R7AexoB突变体中推定的EPS配体的相互缺失。 ExoB是合成EPS合成的第一步所需的UDP-半乳糖的UDP-葡萄糖4-差向异构酶，并且R7AexoB不合成EPS。 与R7AexoU不同，R7AexoB在岐阜形成感染的结节，尽管延迟后（扩展数据图6a）。

使用R7AexoB或R7A以10和14dpi在Gifu，epr3-10和epr3-11上评分感染线形成。 与R7A相比，用R7AexoB接种的岐阜植物中感染线的总数在10和14dpi下降至约一半，表明野生型EPS的阳性功能（图3a）。 在相互实验中，接种R7A的epr3-10和epr3-11中的感染 - 线形成减少到大约一半，表明EPR3促进有效的感染 - 线起始（图3a）。 与R7A接种的epr3-10和epr3-11植物相比，在R7AexoB中也观察到感染线形成的减少，这可能反映了EPS的被动理化作用。 对于Gifu和epr3突变体，与R7A接种的植物相比，到达皮层边界的感染线的数量在10和14dpi时显着减少。

这些观察表明，野生型EPS和功能性EPR3受体都是持续感染 - 线程启动所必需的。 为了进一步证实EPS和EPR3之间的功能关系，在R7AexoB接种的Gifu和epr3-11植物上检查纯化EPS（100mg ml）的效果。 岐阜感染线程显着增加，而epr3-11未检测到增加（图4a）。 Epr3依赖EPS增加的正效应支持配体 - 受体关系的概念。

a 60

36

b

37

c

37

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20

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38

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Short IT

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20

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Long IT

17 18

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17

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17

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16

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18

20

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50

40

Number of ITs per plant

图3 | EPS感知促进感染线程的发展。

a，R7A，R7AexoB或R7AexoU之后感染线程（IT）的频率接种岐阜，epr3-10和epr3-11。 总结了10种植物在10和14dpi时R7AexoU诱导的长感染线的数量为：岐阜0和1.5; epr3-10,5和9.4; epr3-11,2和3.5。

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