白藜芦醇衍生物的发现作为新型LSD1抑制剂：设计、合成及其生物学评价外文翻译资料

 2023-01-05 17:57:37

白藜芦醇衍生物的发现作为新型LSD1抑制剂：设计、合成及其生物学评价

原文作者：Yi-Chao Zhenga,Yuan-Yuan Guan b, Xiao-Yu Zhai a, Li Na Ding c, Wen-Ping Qin a, Dan-Dan Shen c, Xue-Qi Liu c, Xu-Dong Sun c, Yi-Chao Zheng c, **, Hong-Min Liu c,* 单位：Xinxiang Medical University

摘要：抑制赖氨酸特异性的去甲基化酶1(LSD1)的治疗近来成为治疗癌症和其他疾病的一个强有力方法。我们连续不间断地识别新型小分子LSD1抑制剂并设计合成了一系列白藜芦醇衍生物，而它正是LSD1的有效抑制剂。其中，化合物4e和化合物4m的IC50值分别为121nM和123nM，显示出了最强的LSD1抑制活性。生物化学研究和对接分析表明，化合物4e和4m是可逆的LSD1抑制剂。高含量分析表明，4e和4m对诱导组蛋白H3的二甲基化LYS4的剂量依赖性增加，对MGC-803细胞中LSD1的表达没有影响。此外，4e或4m可以显著增加CD86的mRNA水平，CD86是LSD1活性的细胞生物标志物替代。说明它们可能在MGC-803细胞中表现出LSD1抑制活性。这些发现应该可以发展对这些化合物进行进一步的修饰，以研发具有潜在抗癌活性的更强效的LSD1抑制剂。

关键词：白藜芦醇衍生物; LSD1; 抑制剂合成

  1. 介绍

组蛋白赖氨酸特异性脱甲基酶1(LSD1)是第一个被鉴定为负责特异性去除单和二甲基化的H3K4和H3K9[1]甲基的脱甲基酶，LSD1还可以脱去许多非组蛋白的甲基，如p53[2]，DNA甲基转移酶(DNMTs)[3],E2F转录因子1(E2F1)[4]，肌球蛋白磷酸酯酶目标子1(MYPT1)[5]。这种遗传翻译修饰调节许多生物过程，包括细胞分化，基因激活和基因抑制[6]。最近的研究报道，LSD1在多种类型的恶性肿瘤中异常地过度表达，这与肿瘤的发生和发展有关，减少了分化，且引发不良预化[7-15]。LSD1的消除对于急性髓系白血病(AML)[16]，乳房[17,18]，肺[19]，胃[20]，直肠癌等[21]，可诱导多种表观遗传学沉默肿瘤抑制基因来抑制细胞增殖、迁移和侵袭。据报道当LSD1抑制剂与泛高密度脂蛋白胆固醇抑制剂组合时表现出协同抗癌活性[22-26]。因此，LSD1已成为治疗人类恶性肿瘤的一个有前途的靶点[27-29]。

自2004年发现LSD1以来，已经确定了许多不同的LSD1抑制剂分支[30-32]。研究槜广泛的和最有效的LSD1抑制剂是不可逆的，而且是基于著名的抗MAO试剂：强内心百乐明（用以抑制单胺氧化酶的抗抑郁药）(TCP,1)[33-38](图1)来设计的。直到现在，两种基于三氯苯酚的LSD1抑制剂ORY-1001(2)和GSK2879552(3),正在进行癌症治疗的临床试验[39，40]。其它LSD1不可逆抑制剂正着重于苯乙嗪-(4)[41]和炔丙基胺基化合物(5，6)[17,42]的发展。最近，强有力的、类药物的和可逆的小分子LSD1抑制剂的开发引发兴趣热潮。各种不同的抑制剂，包括偕胺肟基化合物(7)[19]，脒基胍化合物(8)[43],氨基三唑(9)[44],含吡啶化合物(10)[45]。苯基噁唑(11)[46]和物质[20，21，44，47-51]都已被报道为可逆的LSD1抑制剂。我们团队以前开发的一系列基于三唑-二硫代氨基甲酸酯的LSD1抑制剂和最有效化合物(12)都对LSD1高表达胃癌细胞株具有明显的抗增殖作用，对细胞迁移和侵袭有明显的抑制作用[52](图2)。尽管在开发有效组蛋白去甲基化酶抑制剂方面取得了进展，但真正有希望的候选药物却很少。新的有效LSD1抑制剂仍有待鉴定。

图1：报道的代表性不可逆LSD1抑制剂

图2：报道的代表性可逆LSD1抑制剂

白藜芦醇(RES)是花生,各种浆果，葡萄和红酒中存在的一种天然多酚。白藜芦醇已被证明对于对抗炎症[53]，心血管疾病[54]、阿尔茨海默病[55]和衰老[56]具有很好活性。最近的研究表明白藜芦醇有很强的抗癌作用[57]。通过其对包括白血病[58]、乳腺[59]、胰腺[60]、结直肠[61、62]、肝细胞[63]和前列腺癌[64]在内的多种癌细胞系的生长的体外和体内抑制作用证明了这一点。最近，发现白藜芦醇对LSD1具有强抑制活性，且比TCP[65]更具活性。因此，白藜芦醇作为LSD1抑制剂有望进一步发展。受Woster团队报道的偕胺肟类LSD1抑制剂和白藜芦醇LSD1抑制活性的启发，我们合理地设计了一组带有偕胺肟支架的白藜芦醇衍生物(图3)，得到了一系列新的可逆LSD1抑制剂。

图3：本文设计合成了新型LSD1抑制剂

2.结果和讨论

2.1化学

白藜芦醇衍生物的合成路线概述在方案1和2中。化合物1a-b由3-氰基或4-氰基苄基溴和磷酸三乙酯通过熊果苷反应合成，参考文献[66]。1a-b与不同取代苯甲醛的霍纳尔－沃兹沃思－埃蒙斯反应反应得到二苯乙烯衍生物2a-n、6和7，产率较高。甲氧基含化合物2b-n混合BBr3在干燥的CH2Cl2中合成化合物3b-n。在回流温度下用羟胺和三乙胺在甲醇中处理2a、3b-n、6和7分别得到所需的脒肟4a-n、8和9。化合物5由3i在盐酸存在下用水合肼处理制备。所有化合物均经1HNMR、13CNMR和电喷雾质谱（ESI）表征。

方案1：化合物2-5的合成。试剂和条件:(a)二甲基甲酰胺，叔丁醇，0℃-rt，0.5-2h：(b)BBr3，二氯甲烷，-35℃-rt，过夜；(c)NH2OH﹒HCl，Et3N、CH3OH、回流，3-5h；(d)(i)3i，乙醇，盐酸(气体)，0℃-rt，2h；(ii)NH2NH2﹒H2O,乙醇,室温,3h.

方案2：化合物8-9的合成。试剂和条件:(a)1a、叔丁醇，叔丁醇钾盐，0℃-rt，1h；(b)1b、二甲基甲酰胺，叔丁醇，0℃-rt，2h；(c)NH2OH﹒HCl，Et3N，CH3OH，回流，5h.

2.2合成化合物对重组酶LSD1酶的抑制作用

对合成的化合物进行体外抑菌活性研究。三氯丁二烯和苯乙烯分别为作为阳性对照。如表1所示，除了化合物4h和4n之外，所有化合物都表现出中等至强的抑制LSD1活性。其中，在苯环上具有羟基取代基的化合物4b-4g和4i-4m具有较强的抑制活性，其IC50值在121nM至2.59mM之间，比TCP和RES都强。其中4e(IC50121.23nM)和4m(IC50123.86nM)具有最强的抗LSD1活性，是RES的80倍。与化合物4j或4i相比，无羟基取代基的化合物4a在10mm处对LSD1的抑制率仅为48.9%，但化合物4h和4n活性缺失的原因尚不清楚。用吡啶环(4bvs8)或吲哚环(4ivs9)取代苯基支架导致活性显著降低，这表明苯环在保持其活性方面具有一定意义。通过比较4i和5，将苯并咪唑酰胺转化为苯并咪唑酰肼显著降低了抑制活性。间氨基肟取代是优选的:间氨基肟取代的衍生物(4b-4g)比相应的对氨基肟取代的衍生物对抗LDS1更有效。

表一：化合物4a-n、5、8和9的体外LSD1抑制活性

接下表：

a.数据表示为10mM或IC50值时的抑制百分比(平均SD)。所有实验独立进行至少三次。

b.未测试。

c.无抑制作用。

2.3可逆性研究

为了测试4e(图4A)和4m(图4B)的LSD1的可逆性，我们使用稀释测定法。并发现，将LSD1/化合物混合物稀释80倍可使LSD1活性恢复。然而，在共价结合抑制剂GSK2879552[67]的存在下，稀释后不能恢复LSD1活性。这些结果表明4e和4m与GSK2879552相比具有可逆性，这意味着4e和4m能够以非共价方式与LSD1重组体结合。

图4：稀释法测定4e(A)和4m(B)对LSD1活性的可逆性，以GSK2879552为对照。数据是平均标准差。误差考虑为**plt;0.01，差异有统计学意义。所有实验至少进行三次。

2.4 4e和4m对MGC-803细胞的抑制作用

为了进一步确认4e和4m的细胞活性，将不同浓度的4e和4m应用于过度表达的LSD1[68]的胃癌细胞系MGC–803中。如图5所示，将MGC-803细胞接种在96孔板中，并用这些抑制剂处理5天。然后用H3K4me2抗体对细胞进行免疫荧光，以指示细胞中LSD1的活性。同时，DAPI也用于细胞计数(图5)。用高含量分析的12目免疫荧光分析每个孔，评价H3K4me2的强度，H3K4me2的强度与细胞数的比值指示LSD1的活性。从图6可以看出，当用4e(图6E)和4m(图6F)处理细胞三天时观察到4e(图6A)和4m(

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