地上部位中花青素类、黄酮类、多酚类提取物的抗氧化和抗菌活性研究外文翻译资料

 2023-01-07 15:42:20

Thymus kotschyanus boiss amp; hohen 地上部位中花青素类、黄酮类、多酚类提取物的抗氧化和抗菌活性研究

Robabeh Baharfar，Razieh Azimi ，Mojtaba Mohseni

摘要：本研究分别对Thymus kotschyanus地上部分中黄酮类(水、乙酸乙酯和正己烷部位)、多酚类和花青素类提取物中总酚和总黄酮含量进行了测定，并对其抗氧化和抗菌活性进行了研究。所有提取物均含有丰富的酚类和黄酮类化合物，并具有较强的抗氧化活性。其中，水提取物中酚类和黄酮含量最高(分别为881.06plusmn;16.52 mg GAE/g和74.60plusmn;3.05 mg QE/g)。且具有抗氧化性最强，清除DPPHbull;的IC50值为14.21plusmn;0.53 mu;g/mL，还原能力为400 mu;g/mL,A700=2.46plusmn;0.04。所有提取物对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有一定的抑制作用。研究结果为小叶百里香的应用提供了科学基础，并证明其可作为天然抗氧化合物和抗菌化合物的的来源。

关键词：Thymus kotschyanus、总酚含量、富含类黄酮、抗菌活性

引言

消费者希望通过改善饮食来降低患慢性疾病的风险或管理特定的健康状况。抗氧化剂作为食品添加剂被广泛应用于食品的抗氧化降解。为了延长食品的贮存稳定性，合成抗氧化剂被用于工业加工中。然而，由于其潜在的健康风险和毒性，常用的合成抗氧化剂如丁基羟基茴香醚(BHA)和丁基羟基甲苯(BHT)受到立法规定的限制(Imaida等，1983；Kahl和Kappus等，1993)。因此，科学家们现在正在寻找天然存在于植物中的抗氧化剂，作为食品或药材的合成抗氧化剂的替代品(Proestos等，2005；D Abrosca等，2007；Annegowda等，2013)。天然抗氧化剂如酚类化合物、类黄酮、花青素和其他植物化学物质可以作为自由基清除剂、还原剂、氧化金属螯合剂或单线态氧猝灭剂，从而延缓食品中的脂质氧化过程(Rice-Evans等 ，1997；Kahkonen等，1999；Miraliakbari和Shahidi，2008；Sun等，2009；Amarowicz等，2010)。迄今为止，人们已经探索了许多基于自然来源的抗氧化剂来源，但仍然需要寻找新的来源，可能更安全，更经济，最好来源于膳食。

百里香属植物，在波斯被称为百里香，是一种众所周知的芳香的多年生草本植物，原产于地中海地区。在世界上生长的215种该属植物中，有14种分布在伊朗植物区系中(Jalas，1982；Stahl-Biskup和Saez，2002)。百里香属植物是众所周知的药用植物，因为它们具有生物和药理特性，包括解痉、抗病毒、抗细菌、抗真菌、抗寄生虫和抗氧化活性(Stahl-Biskup和Saez，2002)。在传统医学中，百里香属植物的叶子和开花部分被广泛用作滋补和凉茶、防腐剂、镇咳和驱风剂以及治疗感冒(Zargari，1990)。

Thymus kotschyanus的化学成分和生物活性以前已经进行过研究(Rasooli和Mirmostafa，2003；Bagci和Baser 2005；Nickavar等，2005；Morteza-Semnani等，2007；Mohammed 和Al-Bayati，2009)。此外，这种整株植物的水醇提取物具有很强的抗氧化活性(Nickavar和Esbati，2012)。因此，本工作的目的是评价从苦豆树地上部分提取的富含黄酮类、多酚和花青素的提取物的总酚和黄酮类含量、抗氧化和抗菌活性，以确定它们作为抗氧化剂来源以及作为可用于防止食品腐败的抗菌剂的可能性。

材料和方法

化学药品

三氯乙酸(TCA)、福林-西考尔托、没食子酸、槲皮素、抗坏血酸、丁基羟基甲苯(BHT)和1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)购自Sigma-Aldrich化学公司。其他化学试剂均为分析级。

植物材料

2012年6月，在伊朗北部埃勒斯克地区的厄尔布尔士山脉山脉中部采集到了Thymus kotschyanus的地上部分。该植物由伊朗巴伯尔萨马赞兰大学生物系的A.Naqinezhad博士鉴定和认证。标本存放在本机构的标本室，凭证号为4026。

富含黄酮类的提取物(水、乙酸乙酯和己烷级分)的制备。

富含黄酮类的级分的分离如Nabavi等(2012)先前所述进行。因此，将100 g干燥样品用100 mL三氯甲烷脱脂两次，并在室温下用100 mL 60 %丙酮提取两次，每次12小时。提取液经Whatman 1号滤纸过滤后与样品残渣分离。用旋转蒸发器在35℃下去除组合滤液中的溶剂，留下粗丙酮提取物(12 g)。配制10 %甲醇浆液后，丙酮提取物分别用正己烷、乙酸乙酯、水进行分馏。所有提取物在40℃下用旋转蒸发器干燥。提取液得率以植物物质干重表示。

多酚和花青素的提取

根据张等人(2000)提出的改良方法，从粉碎的地上部组织(100 g)中提取多酚和花色苷。在摇瓶培养箱中于20℃进行两次提取(ZHWY-200B，中国上海志诚分析有限公司)。提取时间为30 min，提取溶剂为100 mL含1 %甲酸的甲醇/丙酮/水(3.5:3.5:3，体积比)。提取液经Whatman 1号滤纸过滤后，从样品残留物中分离出提取物。从样品残留物中分离出提取物。然后，用两倍体积的石油醚在分离漏斗中连续两次萃取，将亲脂色素从水相中除去。收集水相，用乙酸乙酯(乙酸乙酯:水相=1:1,v/v)在分离漏斗中进一步提取3次。收集3个乙酸乙酯相，35℃真空蒸发干燥，得到多酚样品。水相也在50℃真空干燥，并用作花青素样品。所有样品在进一步检测前保存在minus;20℃。

总酚含量(TPC)测定

总酚含量通过福林-西考尔托法测定(Meda等，2005)。提取液冻干粉各4 mg，分别用50 mL去离子水溶解。取0.5 mL提取液，加入福林-西考尔托试剂(0.2 N, 2.5 mL)5 min，再加入0.75 g/L碳酸钠2.0 mL。室温下孵育30分钟后，用分光光度法在760nm处测定反应的吸光度。结果以没食子酸当量(GAE)/g干提取物表示。

总黄酮含量的测定

采用氯化铝比色法测定总黄酮含量(Willet ，2002)。提取液冻干粉各4 mg，分别用50 mL去离子水溶解。将该溶液(0.5 mL)与1.5 mL甲醇、0.1 mL 10 %氯化铝、0.1 mL 1 M乙酸钾和2.8 mL蒸馏水混合，并在室温下放置30分钟。反应混合物的吸光度在分光光度计(紫外-可见EZ201，Perkin Elmer，美国加利福尼亚州诺沃克)上在415nm处测量。以槲皮素当量(QE)/g干提取物计算总黄酮含量。

DPPH自由基清除活性

采用稳定的1,1-二苯基-2-苦基肼自由基(DPPH)测定提取物的自由基清除活性(Brand-Williams等，1995年)。将2 mL不同浓度的提取物(5 ~ 80 mu;g/mL)加入100 mu;M的DPPH甲醇溶液中。室温15 min后，在517nm处记录吸光度。实验重复三次。以抗坏血酸和BHT作为标准对照进行比较。IC50值表示清除50% DPPH自由基所需的样品浓度。

还原力

根据Yen和Chen(1995)的方法确定了馏分的还原能力。将2.5 mL不同浓度的样品(25~400 mu;g/mL，在水中)与磷酸盐缓冲液(2.5 mL, 0.2 m, pH 6.6)和铁氰化钾[K3Fe(CN)6] (2.5 mL, 1%)混合。混合物在50℃孵育20 min。向混合物中加入一份(2.5mL)三氯乙酸(10 %)以停止反应，然后以3000 r/pm离心10 min。将上层溶液(2.5 mL)与蒸馏水(2.5 mL)和三氯化铁(0.5 mL，0.1 %)混合，在700nm处测定吸光度。以抗坏血酸为阳性对照。

抗菌活性(纸片扩散试验)

采用miller-hinton琼脂圆盘扩散法测定提取物的体外抗菌活性并确定抑制区(IZ)(Kirby-Bauer法；Drago等，1999)。革兰阴性菌和革兰阳性菌分别为:大肠杆菌PTCC 1330、铜绿假单胞菌PTCC 1074、金黄色葡萄球菌ATCC 35923和枯草芽孢杆菌PTCC 1023。将20 mu;L提取物(20 mg/ml二甲基亚砜)涂于直径为6 mm的纸盘上。将纸片放在营养琼脂平板上，该平板预先接种了含有指示微生物的接种物。37℃孵育24小时后，测量生长抑制区的直径。以已知抗生素庆大霉素(10 mu;g/片)和氯霉素(30 mu;g/片)为阳性对照，二甲基亚砜(20 mu;L/片)为阴性对照，比较提取物的抗菌活性。

统计分析

实验结果为三次平行测量的平均标准差，用SPSS 18进行分析。平均值之间的差异通过方差分析和图基多重比较以及最小显著性差异来确定。相关性由二元相关中的皮尔逊相关系数获得。p值le;0.05被视为显著。

结果和讨论

提取率、总酚和黄酮含量

表1列出了Thymus kotschyanus地上部分的酚类化合物和黄酮类化合物的含量，以及提取量。各提取物的得率从0.43%到7.52 %不等。水馏分的产率最高(7.52 %)，其次是花色苷馏分(6.41 %)、多酚馏分(2.57 %)、乙酸乙酯馏分(0.58 %)和己烷馏分(0.43%)；差异显著(plt;0.05)。

采用福林-西考尔托试剂分光光度法测定提取物的TPC，参照标准曲线(y=0.0054x 0.0628, R2=0.987)按没食子酸当量计算。在所有提取物中均观察到高酚含量，范围很广，309.31~881.06 mg GAE/g干提取物(表1)。结果表明，水部分酚含量最高(881.06plusmn;16.52)mg GAE/g，其次是乙酸乙酯部分(751.56plusmn;6.91)mg GAE/g，己烷部分(555.72plusmn;5.23)mg GAE/g，多酚部分(391.14plusmn;10.82)mg GAE/g，花青素部分(309.31plusmn;15.84)mg GAE/g；两者有显著性差异(plt;0.05)。

以槲皮素为标准分光光度法记录各提取物总黄酮含量(y=0.0063x, R2=0.999)。干提取物的TFC范围为32.04 ~ 74.60 mg QE/g(表1)。水提取物的TFC最高，而花青素提取物的最低；提取物之间的TFC差异同样显著(plt;0.05)。提取物TPC和TFC的变化可能归因于提取溶剂的不同极性以及内源可提取化合物的化学性质(Jaffery等，2003)。

自由基清除活性

DPPH自由基清除试验是一种广泛使用且相对容易的评估抗氧化活性的方法。抗氧化剂分子通过供氢或供电子的过程清除DPPH自由基，来自DPPH分析溶液的紫色变为浅黄色，可通过其在517纳米波长处吸光度的下降来定量(Blois，1985)。自由基清除是抗氧化剂抑制脂质氧化的已知机制之一。

图1显示了不同提取物和标准抗氧化剂在不同食品科学技术浓度下对DPPH自由基的抑制率。IC50(清除50% DPPH所需的样品有效浓度)由高到低依次为:花青素提取物(IC50:41.13plusmn;5.94 mu;g mL)gt;多酚提取物(IC50:32.66plusmn;3.16 mu;g mL)gt;己烷提取物(IC50: 23.71plusmn;3.68 mu;g mL)asymp;乙酸乙酯提取物(IC50: 23.71plusmn;1.21 mu;g mL)gt;水提取物(IC50:14.21plusmn;0.53 mu;g mL)gt;BHT(IC50:13.18plusmn;3.11 mu;g mL)gt;抗坏血酸(IC50:6.56plusmn;0.12 mu;g m L)；两者有显著性差异(plt;0.05)。然而，所测试的提取物表现出显著的清除DPPH自由基的能力，IC50值为mu;g mL。值得注意的是，水提取物中酚类和黄酮含量最高，其清除DPPH自由基的活性优于其他提取物(plt;0.05)，其IC50值略高于抗坏血酸和BHT (pgt;0.05)。有趣的是，当样品浓度大于20 mu;g mL时，水馏分的自由基清除活性高于BHT。

结果表明，黄酮提取物(水、乙酸乙酯和正己烷馏分)对DPPH自由基的清除能力明显高于毛茛醇提物(IC50为31.47 mu;g/mL)和小叶百里香醇提物(IC50为47.22 mu;g/mL)；(IC50为68 mu;g/mL) (Nickavar和Esbati，2012)。

抗氧化能力与酚类/黄酮含量的关系。

酚类化合物是一类抗氧化剂，由于它们的氧化还原性质，使它们作为还原剂，氢供体和单态氧猝灭剂(Chang等，2001)。黄酮类化合物是一类酚类植物成分，通过清除或螯合作用表现出抗氧化活性。

在我们的实验中，观察到萃取物的TFC值与TPC数据有很好的相关性(R2=0.86)。这说明黄酮类化合物可能是黄酮在黄酮含量中占主导地位(图2a)。此外，不同提取物中酚和类黄酮含量与DPPH清除能力(以计算的IC50值的倒数表示)呈显著的线性关系(R2=0.99，p lt; 0.

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