中国东南部长叶榧与榧树（红豆杉科）自然杂交外文翻译资料

 2023-01-07 15:44:03

Natural hybridization between Torreya Jackii and T.grandis (Taxaceae) in southeast China

——中国东南部长叶榧与榧树（红豆杉科）自然杂交

摘要：对自然杂交的认识有助于理解生物多样化的起源和维持。基于中间形态和重叠分布,在中国东南部的九龙山榧被认定为榧树和长叶榧的自然杂交种。该项研究测试了九龙山榧核内转绿间隔区（ITS）和细胞质（叶绿体rbcL、rph6和线粒体rps3）的DNA序列。研究结果表明,九龙山榧核ITS序列的大多数杂合位点表现出了介于长叶榧和榧树之间的加和性。在系统发育关系中,九龙山榧的ITS序列分别和长叶榧、榧树聚为一支。同时,九龙山榧所有的叶绿体和线粒体单倍型与长叶榧相近,而不是榧树。在叶绿体DNA系统发育树上,九龙山榧被归类为长叶榧。这些结果表明,九龙山榧是自然杂交种,其母本为长叶榧,父本为榧树。本研究认为榧树谨慎种植的长叶榧旁边,因为其濒临灭绝的状态可能会由于杂交而恶化。

关键词：细胞质DNA,ITS,自然杂交,中国东南部,榧属植物

物种形成的原因和性质对于了解世界生物多样性的起源和维持至关重要（Soltisamp;Soltis, 2009）。长期以来,杂交一直被视为植物物种形成的重要机制（Grant,1981）。对自然杂交过程的研究可能有助于阐明生物多样性和其过程的持续,并有助于理解许多适应的起源（Soltis＆Soltis.2009）。杂交在裸子植物中很普遍,并且已经对裸子植物中的杂交进行了许多研究,例如高山松和紫果云杉（Wang et al.,2001; Sun et al., 2014）。然而从未有关于红豆杉科小属榧树属自然杂交的信息。

榧属（红豆杉科）植物间断分布于东亚-北美（Kang amp; Tang, 1995; Farjon, 2010）,包括6种2变种。这些种大多数具有异相分布（Kangamp;Tang, 1995）,这可能解释了该属中种间杂交罕见的情况。然而,长叶榧和榧树2种是中国东南部同域物种,为产生尚未确定的杂交物种提供了充足的机会。在生态和形态上,这2种有很大的不同。榧树有的是短（1.6-3.0cm）而呈浅绿色的叶子,生长在高山和开阔的山谷中,有时也在高200-1400m的溪流中生长。由于榧树的种子能够食用并且可以榨油,已被中国人利用了几个世纪（Cheng et al., 2007）。相反,灌木状的长叶榧有的是更长（6.2-14.7cm）、深绿色的叶子,主要生长在人迹罕至地方的岩石上（Kang amp; Tang, 1995; Gao,1997; Li, 2013）。在1995年Kang和Tang基于浙江九龙山的三份标本发表了九龙山榧。由于九龙山榧叶片长度介于长叶榧和榧树,我们怀疑该种可能是种间杂种。但是,植物对各种环境因素的响应通常表现出很高的形态可塑性,仅以中间形态（尤其是叶片形态）是不足以鉴定为自然杂交种的（Zhang et al., 2013）。

来自核和细胞质基因组的分子序列数据可用于检测植物的自然杂交种起源（Sang et al., 1995）。结合双亲遗传核DNA和单亲遗传胞质DNA的序列,区别杂交种的父本和母本是可行的（e.g., Yah et al., 2013; Zhang et al., 2014）。这项研究中,我们使用核基因组核糖体DNA内部转录间隔区（ITS）和细胞质DNA序列（叶绿体（cpDNA）rbcL、rpl16和线粒体DNA rps3）来研究九龙山榧是否是长叶榧和榧树的自然杂交种,如果是的话,哪种是父本或是母本。

材料和方法

分类群采样

我们进行了广泛的野外调查,以寻找尽可能多的野生九龙山榧种群。但是九龙山榧除了最初发现该种的九龙山外,仅在两个地点被发现（图1;表1）。此外,逐渐成长的九龙山榧在九龙山极为稀少,每个地点仅有一两株。对于推断的亲本,长叶榧和榧树在两个地点与九龙山榧有共同分布,并在每个共同地点收集了一两个被认定为亲本的个体（图1;表1）。我们也在并没有九龙山榧生长的地方采样了长叶榧和榧树（图1;表1）,并立即将所有采摘的新鲜叶片保存在硅胶中。根据三个焦点类群中的稳定的可诊断的形态特征鉴定植物。这些形态描述在表2中示出。

图1. 长叶榧的样本站点和叶子照片（A）,九龙山榧（B）,榧树（C）。实线和虚线的圆圈范围分别表示长叶榧和榧树的主要地理分布。正方形,三角形和圆形分别表示长叶榧、榧树和九龙山榧的采样点。九龙山伤的粗体圆圈表示九龙山榧变种的标本采集地点；九龙山上的两个虚线圆圈表示这三个物种的地理共同分布点。根据中国国家测绘地理信息管理局（http://www.sbsm.gov.cn）的绘制标准,使用CorelDraw X4（加拿大渥太华的Corel公司）绘制了中国的轮廓图。每个物种的位置代码如下（均在中国）：长叶榧（）：1,福建泰宁；2,浙江松阳；3,浙江仙居；4,浙江桐庐；5,浙江仙居；6,福建邵武；7,浙江缙云。九龙山榧（〇）：1,浙江遂昌；2,浙江丽水；3,浙江磐安；4,浙江磐安。榧树（Delta;）：1,江西丽川；2,浙江松阳；3,浙江磐安；4,浙江建德；5,浙江临安；6,浙江诸暨；7,浙江缙云

DNA提取,聚合酶链反应扩增和测序

使用改良的CTAB程序从大约20 mg干燥的叶子中提取基因组DNA（Doyle＆Doyle, 1987）。聚合酶链反应（PCR）的体积为25 micro;L,包含19.0micro;l无菌水,2.5micro;L的10times;PCR缓冲液,0.25micro;L的10mmol/L dNTPs,1.0micro;L的5micro;mol/L浓度的引物,0.25micro;L的5U/micro;L rTaq DNA聚合酶（Takara, Dalian, China）和1.0micro;L提取的DNA（20-40 ng/micro;L）。使用Small等人（1998）,Hao等人（2008）和Ran等人（2010）报道的引物分别扩增了ITS,cpDNA区域的rbcL和rpl16以及mtDNA区域的rps3。按照以下步骤进行PCR扩增：94℃初始变性5 min,94℃变性40s中进行35次循环,52-55℃退火1min（rbcL和rps3为52℃,rph6和ITS为55℃）,在72℃时1min延伸10s,接着在72℃下最终延伸7min。在用琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒（Takara）纯化后,使用PCR引物直接对PCR产物进行测序。所有测序反应均在ABI3700自动DNA测序仪上进行（(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）。

通过直接测序发现杂合位点的ITS PCR产物使用琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒（Takara）进行纯化,然后按照推荐的方案使用pMD19-T载体（Takara）进行克隆,并转化为感受态大肠杆菌JM109在42℃。在含有100 mg/ mL氨苄青霉素的固体LB培养基上于37℃过夜筛选转化的细菌。使用通用引物（M13-47和RV-M）扩增和测序至少五个阳性克隆。这三个焦点榧属分类群的所有序列都已存放在GenBank中（登录号列于表1）。由于种间杂交可能因密切相关的物种之间的不完全谱系排序而混淆（例如,Wilyard et al., 2009; Zhou et al., 2010）,其余包括其他榧属植物（日本榧,巴山榧,云南榧,加州榧,佛罗里达榧）以及外类群穗花杉的基因组序列可以从GenBank上下载以进行分子系统发育分析（登录号KJ588912一KJ589031）。

序列比对和系统发育分析

使用ClustalX 1.83对三个基因组的DNA序列进行比对和编辑（Thompson et al., 1997）。使用程序GapCoder（Young＆Healy, 2003）对所有ITS序列的插入/缺失进行编码。由于叶绿体基因组的遗传像没有重组的位点一样,因此将cpDNA区域rbcL和rpl16链接到一个单一的矩阵中。基于PhyML3.0（Guindon et al., 2010）的最大似然（ML）分析,建立了榧属植物的分子系统发育关系,并使用MrBayes 3.1.2（Huelsenbeck＆Ronquist, 2001）进行贝叶斯推断。rps3的序列没有用于系统发育分析,因为它们包含的可变位点非常少。根据赤池信息量准则（AIC）,使用jModelTest 2.1.5找到了用于系统发育分析的最佳替代模型（Darriba et al., 2012）。基于jModelTest的结果,将GTR G模型应用于ITS序列（-InL = 2627.3240,AlCc = 5416.6480）和GTR I G模型建立cpDNA矩阵（-InL = 3455.3625,AICc = 7042.7250）。Web sevrer使用默认设置（http://atgc.lirmm.fr/phyml/）进行了最大似然分析。该引导程序支持1000次重复计算。对于贝叶斯分析,四个Monte Carlo Markov链两次运行2times;10代,每1000代采样一次。样本的前25％被丢弃为老化,其余树用于构建具有后验概率的50％多数规则共识树。通过网页的默认设置（http://atgc.lirmm.fr/phyml/）进行最大似然分析,该引导程序支持1000次重复计算。对于贝叶斯分析,四个蒙特卡洛马尔科夫链两次运行了2times;106代,每1000代采样一次。样本的前25%因老化被丢弃,其余树用于建构具有后验概率的50%多数一致树。

结果

序列变异

对齐的核ITS总长为1173bp,在三个焦点类群中具有14个可变位点（表3）。推断的亲本在10个位点（57,313,357,613,656,710,961,1043,1129和1152bp,以下称为固定差异）一致。在其他四个可变位点中（405,416,1038和1067bp）,榧树是单态的,但是长叶榧对于至少两个个体是多态的,这可能是预先的存在的多态性,因为在松柏类植物中的核ITS的进化树总是不完整的（Karvonenamp;Savolainen, 1993）。根据推定亲本之间的10个固定差异处,推断杂交种有两种组合类型：个体1和2显示出精确的可加性,而个体3和4仅在部分位点上显示出可加性,其他位点与长叶榧相同（个体3在位点313,357和961bp；个体4在313,613,710,961,1043,1129和1152bp；表3）

rbcL和rpl16的对比矩阵在三个焦点类群中共有2111bp,在每个分类单元中未发现变异序列。九龙山榧的序列和长叶榧的相同,但在10个位点中与榧树不同（表4）。对于线粒体基因片段rps3,我们从三个焦点类群中获得了总计1100bp的片段。在九龙山榧中法系哪了2种mtDNA单倍型,这两种单倍型仅在长叶榧中有,榧树中未发现。

系统发育关系

总体而言,ML系统发育树的拓扑结构和贝叶斯树一致,因此仅报告了ML树的结果。在核ITS的ML树上,所有榧属植物（不包括九龙山榧）形成了单系进化枝,具有较高的支持值（引导支持和后验概率为0.76-1.00; 图2）,其中长叶榧和榧树彼此靠近。意料之中,九龙山榧的克隆分为2支,分别深入到长叶榧和榧树之中。有趣的是,个体1-4的两个ITS克隆中的每一个都与长叶榧或是榧树相聚成簇。在cpDNA树上,尚未完全解决榧属植物之间的关系。然而长叶榧和榧树被嵌入两个支撑良好的进化枝中。与变异序列的模式一致,九龙山榧与长叶榧聚为有高支持率的一支（引导支持为0.89,后验概率为0.97; 图3）

其他的榧属植物在cpDNA树上形成了具有高支持率的单系进化枝（引导支持和后验概率为0.7-1.00; 图3）

讨论

自然杂交

假定父母的地理共生和在几个性状中处于形态学中间态通常暗示密切相关物种之间的自然杂交种（Gottlieb, 1972）。九龙山榧出现在长叶榧和榧树的共生区域内,其形态特征（尤其是叶长）介于长叶榧和榧树之间（表2; 图1）。基于这些线索提出了一个假说,即九龙山榧可能是长叶榧和榧树的杂交种。但是,由于显性、上位性、可加性和连接性的影响,紧密相关的物种之间重叠的地理分布不一定会导致杂交,形态中间态也并不是总与杂交种相关（Barton, 2001）。本研究中,九龙山榧的ITS序列在ITS系统发育树中分为两支,一支与长叶榧相聚,另一支与榧树相聚（图2）,这也明显说明了九龙山榧的杂交性。此外,我们发现了九龙山榧的变种（1和2）,这表明在长叶榧和榧树之间的所有ITS固定差异位点均具有可加性（表3）,这也表明了这些个体可能是长叶榧和榧树的杂交种。

在松柏类植物中杂交甚至是杂交物种形成都是非常普遍的（例如, Wang et al., 2001; Delgado et al., 2007; Kou et al., 2014; Sun et al., 2014）,因为它们本质上是二倍体,雌雄同株,风媒传粉,并且仅进化了一些简单的机制来控制近交（Williams, 2009）。榧属是红豆杉科中的一个小属,雌雄同株的风媒传粉,2n=22（Murray, 2013）,这使得当两个物种在一个地理区域内同时传粉时,可能有助于杂交,有利于自然杂交的另一个因素是传粉时间的重叠。碰巧的是,长叶榧和榧树都在4月进行传粉（Cheng＆Fu, 1

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