修饰细菌人工染色体应用于斑马鱼的转基因研究外文翻译资料

 2023-01-07 15:44:42

修饰细菌人工染色体应用于斑马鱼的转基因研究

原文作者 Zhongan Yang

单位 美国加州大学洛杉矶分校分子、细胞和发育生物学系

摘要：利用细菌人工染色体（BAC）进行转基因在指导外源基因表达方面具有很大的优势。将这项技术应用在透明的斑马鱼身上，能够很好的对生物体中的基因表达调控进行视觉分析。文中描述了一个用于斑马鱼转基因分析的简化程序，即从公共序列数据库中直接选择多个BAC克隆，然后用GFP或RFP进行快速修改。并详细介绍了BAC DNA的制备、斑马鱼胚胎的显微注射和转基因斑马鱼GFP/RFP修饰BAC克隆的筛选。

关键词：转基因斑马鱼；GFP；RFP；修饰；斑马鱼BAC和PAC

1 引言

斑马鱼是一种极好的模式生物，它能够将正向遗传学、实验胚胎学、功能基因组学和分子生物学结合起来从而理解脊椎动物的发育。此外，斑马鱼基因组测序项目也即将完成。目前，我们面临的挑战是了解脊椎动物基因组中通常所包含的3万多个基因的表达、调节和功能。目前，在斑马和其他生物中，涉及全基因组的RNA原位杂交、基于质粒报告基因进行转基因和正向遗传学的方法是解决这些基本问题的常用工具。在表达分析方面，全套RNA原位杂交缺乏分辨率，需要固定的胚胎，而目前的转基因技术由于缺乏足够的调控基因组序列，往往缺乏再现内源性基因表达模式的保真度。

在各种生物体中获得的大量实例表明，细菌人工染色体（BAC）转基因是一种更有效的直接转基因表达方法。BAC是一种克隆载体，可以容纳高达300kb的大基因组DNA插入。并且在大多数情况下，BAC转基因结构比其他较小的插入载体能更好地指导转基因表达，因为它们可以包含分布在几十或几百个碱基上的远端调控序列。在过去的几年中，已经建立了一些基于同源重组的BAC修饰方法，这些方法能够将基因精确的插入到大DNA片段中。我们以前曾采用一种有效的方法来修饰BAC，以进行小鼠神经元基因表达的高通量转基因研究。同时，我们在斑马鱼身上测试了这种方法，并针对不同的斑马鱼基因修改了100多个BAC克隆。本文描述了BAC转基因的详细步骤，包括根据基因组序列选择BAC克隆、在大肠杆菌中将GFP或RFP插入BAC中以及通过在受精卵中微注射修饰的BAC DNA产生转基因斑马鱼。

2 含有目的基因的BAC克隆的鉴定

斑马鱼基因组BAC文库CHORI-211是桑格研究所在斑马鱼基因组测序项目中使用的BAC文库之一。我们致力于从这个库中选择理想的BAC克隆，现在许多实验室都有自己的克隆，或者可以从BACPAC资源中心购买单个克隆。从目的基因的cDNA或部分基因组片段中提取的序列被用于“运行爆炸式搜索”，这一搜索使用了斑马鱼基因组的最新组装。在编写本章时，当前的组件是斑马鱼的Zv5数据库。首先选择ContigView来显示基因在叠连群上的位置。在“装饰”的下拉菜单中选择“BAC Ends”后刷新网页，将序列区域扩展到覆盖整个序列或在“跳转到区域”处约400kb的单个叠连群，即可识别相应基因的克隆名称或BAC的ID号。如果没有发现直接覆盖该基因的BAC克隆，则可以选择几个位于靶基因200kb范围内的末端相邻的BAC克隆进行PCR分析。一旦确认，含有目的基因的BAC克隆即可用于进一步的修饰（图1）。

图1，从CHROI-211文库中鉴定相应BAC克隆的流程图。目的基因的cDNA序列通常是已知的，或者可以从ZFIN和NCBI数据库中获得。这些基因的基因组序列可从桑格研究所、UCSC、ZFIN和NCBI的网站获得。在某些情况下，通过搜索相关基因的名称，可以直接从网站上获得相关基因的基因组序列。基因在相关染色体、支架和区块上的位置可从桑格研究所网站获得。对cDNA序列进行Blast/SSAHA搜索。如文中所述，选择“ContigView”，然后在“装饰”下拉菜单中选中“BAC ends”，获得位于感兴趣基因周围区域的相应BAC克隆或BAC末端。从CHORI-211文库中筛选相应的BAC克隆。使用克隆名称作为登录号，通过搜索克隆状态数据库获得BAC克隆。在发现来自CHORI-211文库以外的文库的BAC克隆时，可以通过搜索斑马鱼fpc（斑马鱼基因组指纹项目数据库）来获得相应的CHORI-211 BAC。

如果克隆名称可用，则可以将其用作登录号在克隆位置数据库中进行搜索，从而在CHORI-211库中识别BAC的ID号。如果通过此搜索确定的BAC克隆不是来自CHORI-211库，则可以使用斑马鱼BAC fpc数据库进一步搜索。第二次搜索通常允许识别与目的基因相对应的其他CHORI-211 BAC克隆。如果没有，那么来自CHORI-73、DKEYP或dkeybac库的BAC克隆也可以直接用于修饰。在BlastView窗口中，选择每个基因起始密码子ATG上游约1kb的基因组序列，并选择“导出序列”设计PCR引物。PCR确认中采用的引物是特异性的，以确认所需的BAC。到目前为止，我们已经能够获得约80%的需要修改的基因的CHORI-211 BAC克隆。

3 通过插入GFP、RFP报告基因或其他转基因进行BAC修饰

3.1 BAC确认引物的设计及盒体的构建

实验中设计了两个引物（引物A3R和A5Asc）对相应的BAC克隆进行PCR确认。引物A3R为3反向引物，位于目的基因起始密码子ATG附近的5端。引物A5Asc是5正向引物，位于反向引物的上游约300-500bp处，包含AscI限制位点的序列。该PCR片段被命名为“A盒”，用于修饰程序，而BAC上相应的基因组序列被称为“A盒”。另一个5正向引物（引物A5F）位于盒外上游约100bp处，用于检测同源重组后特异性修饰BAC克隆。

3.2 GFP/RFP报告基因修饰斑马鱼BAC克隆的研究

我们已经成功地用包括GFP、RFP和癌基因在内的许多转基因修饰了BAC克隆。这里我们以GFP/RFP为例来描述这个过程（图2）。

图2，斑马鱼BAC克隆的修饰。（1）利用PCR扩增出与目的基因起始密码子相邻的基因组序列片段并连接到目标载体上。PCR片段位于GFP报告基因上游。（2）将携带Rec A基因的质粒转化到BAC宿主细胞中。该质粒含有一个四环素抗性基因（Tet）和一个对温度敏感的复制起点（T）。（3）通过电穿孔法将携带GFP和A盒的靶向载体导入含有BAC克隆和Rec A质粒的大肠杆菌细胞。随着Rec A基因瞬时表达，在A盒和A盒之间发生同源重组。（4）通过同源重组，将靶向载体整合到BAC克隆中。以氯霉素和氨苄西林为抗菌药物，采用双选法对转化后的细菌进行筛选。黑盒：目标基因的编码区；开盒：UTR；灰盒：目标向量或BAC插入中的框；（T）：Rec A质粒复制的温度敏感源。

3.2.1 GFP/RFP报告基因靶向载体的构建

利用上述引物从靶向基因的BAC基因组序列扩增PCR片段（300-500 bp），再用AscI进行酶切并连接到含有GFP或RFP并用限制性内切酶AscI和SmaI进行了预酶切的靶向载体pLD53.SC2上。因此，PCR片段位于GFP或RFP报告基因的上游，为重组提供了同源序列。将携带A盒的靶向载体转化到与复制源R6k相容的pir2细胞中，然后使用来自Qiagen的Hi-speed Maxiprep试剂盒制备DNA。

3.2.2 Rec-A质粒的转化

将含有细菌Rec A基因的质粒转化到原始BAC宿主细胞中瞬时表达出Rec A酶从而促进同源重组。质粒携带四环素抗性基因和对温度敏感的复制起点，并按照标准的迷你制备方案在大肠杆菌细胞中扩增，方法是30℃下，将它们在含有5mg/ml四环素的LB培养基中进行培养。

将含有靶向BAC克隆的大肠杆菌细胞接种到4ml LB培养基中并在37℃下振荡培养。当OD达到0.3-0.5时，将4ml培养物在冰上冷却至少10min，然后将大肠杆菌细胞收集在2个EP管（1.5ml）中，在4°C、5500rpm下离心10min。用1.5ml冰冷的50mM CaCl2溶液重新悬浮每个EP管中的细胞并在冰上培养5min。在相同条件下再次离心后，将细胞合并悬浮在150mu;l含10%甘油的50mM冰CaCl2溶液中，然后将其等分到3个预冷的EP管中。接下来将Rec A质粒DNA（2-3mu;l）添加到其中一份样品中，并在冰上培养30分钟。在42°C下热休克90s后，添加800mu;l SOC培养基，并在37°C下以225rpm振荡培养细胞1 h。将大肠杆菌细胞涂到含有氯霉素（25 mg/ml）和四环素（5 mg/ml）的LB/琼脂平板上，并在30°C下培养过夜。多余的活性细胞可在-80°C下储存。

3.2.3修饰BAC克隆的同源重组与确认

将含有靶向BAC克隆和Rec A质粒的大肠杆菌细胞接种到含有氯霉素（25 mg/ml）和四环素（5 mg/ml）的2 ml LB中，并在30℃下振荡培养过夜。将1ml过夜的LB培养液转移到100 ml LB中，加入相同的抗生素，在30℃下300rpm振荡培养。当OD值达到0.5-0.7时，将100 ml的培养物在冰上冷却至少15分钟，离心收集大肠杆菌细胞。将细胞重新悬浮于100ml冰冷的10%甘油中离心。此清洗步骤重复一次，然后用200mu;l10%甘油重悬大肠杆菌细胞。将40mu;l样品加到预冷的1.5 ml EP管中，并与2mu;l预先制备的靶向载体（1mu;g的DNA）混合。然后使用电穿孔器2510（Brinkmann仪器）和1mm试管（Brinkmann仪器）进行电穿孔。在1800千伏电压下进行电穿孔，然后将大肠杆菌与1ml SOC培养基混合，并转移到细菌培养管中。在37℃下225 rpm摇动培养1 h后，5500 rpm离心5 min收集细胞，并转移到含有氯霉素（25 mg/ml）、氨苄青霉素（50 mg/ml）和四环素（5 mg/ml）的5 ml LB培养基中，然后在30℃下300 rpm摇动培养过夜。将10、50和100mu;l样品涂于含有氯霉素（25 mg/ml）和氨苄青霉素（50 mg/ml）的LB/琼脂平板上，并在43℃下培养过夜（图3）。

图3，修饰BAC克隆的确认。采用NotI/SalI双酶切法对未修饰的和修饰后的BAC进行双酶切，并采用脉冲凝胶电泳法对其进行分离。经过正确的修饰后，原BAC DNA中存在的一条带预计在修饰后的BAC DNA中向上移动约3.5 kb。这与综合靶向载体的大小相对应。

通过瞬时表达的Rec A蛋白，靶向载体的A盒和BAC克隆中的A盒之间可能会发生同源重组。靶向载体会精确的整合到BAC克隆中，GFP/RFP报告基因受到修饰BAC中包含的调控元件的控制。在高温(43°C)孵化下，质粒会被裂解而清除。

为了筛选正确的修饰BAC克隆，用引物A5F和GFP（5-GCTGCTTCATGTGGTCGGGGTA-3）或RFP（(5-AAGTTCATCAGCCCCTACTGCC-3）反向引物进行PCR。从PCR确认后的修饰BAC菌落和原始未修饰的BAC菌落中提取DNA，用标准迷你制备方案进行制备并用NotI/SalI或NotI/BamHI进行双重消化。利用脉冲凝胶电泳分析修饰BAC和未修饰BAC的消化模式。我们目前使用的是FIGE-Mapper电泳系统（Bio-Rad），在0.25%的TAE中运行1%琼脂糖凝胶约16小时，程序如下。

正向

反向

电压（V）

180

120

初始转换时间（s）

0.1

0.1

最终转换时间（s）

0.4

0.4

斜坡

50% liner

50% liner

在NotI/SalI酶切中，原BAC DNA未修饰的一个条带与修饰后的BAC DNA相比预计增加3.5 kb，而其他所有条带应保持不变。当用NotI/BamHI酶切时，与原BAC相比，修改后的BAC DNA中应该有两个新的条带，并且一个原始条带缺失。两个新条带的总大小应比未修饰BAC的相应条带大3.5kb。这一差异是综合靶向载体的大小。利用盒上游的正向引物测序，可以确定精确整合。在我们的研究中，同源重组的效率在15%-100%之间。

4转基因斑马鱼BAC的产生

4.1修饰BAC DNA的提取

为了制备GFP-或RFP-修饰的BAC DNA，将含有修饰BAC的单个大肠杆菌菌落从含有氨苄西林（50g/ml）和氯霉素（25g/ml）的LB平板中接种到含有相同抗生素的5ml LB平板上。然后将5 ml过夜LB培养物转移到含有上述相同抗生素的250 ml LB培养基中，并在37℃下以300 rpm振荡6 h。

BAC DNA的制备基本上与来自Qiagen的Hi-Speed Maxi Prep Kit的方案相同，但做了以下修改：

1. 再悬液(P1)、裂解液(P2)和中和液(P3)的体积加倍。

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