一种用出芽短梗霉菌ipe-1高效添加CaCO3生产β-聚（L-苹果酸）的pH偏移控制策略研究外文翻译资料

 2023-01-07 15:45:39

一种用出芽短梗霉菌ipe-1高效添加CaCO3生产beta;-聚（L-苹果酸）的pH偏移控制策略研究

原文作者

Weifeng Cao, Weilei Cao, Fei Shen, Jianquan Luo, Junxiang Yin, Changsheng Qiao, Yinhua Wan

单位

State Key Laboratory of Biochemical Engineering, Institute of Process Engineering, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100190, China； School of Chemical Engineering, University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China； China National Center for Biotechnology Development, Beijing 100036, Peoplersquo;s Republic of China； College of Bioengineering, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, Peoplersquo;s Republic of China

摘要：beta;聚（L-苹果酸）(PMLA)因其在医药等行业的潜在应用而引起了业界的兴趣。为了实现可持续的PMLA生产，它需要更换/减少CaCO3的使用，因为残留的CaCO3阻碍了细胞的利用，并产生了大量商业上无用处的副产物石膏。在本研究中，发现比起使用CaCO3与葡萄糖反应产生的CO2量相比，使用可溶性碱能将更多的葡萄糖转化为CO2。此外，由于可溶性碱的高离子强度和呼吸作用抑制了PMLA的产生，因此它不能有效地代替CaCO3。此外，比较不同中和剂(可溶性碱与CaCO3)的发酵，发现差异基因主要参与淀粉和蔗糖代谢、戊糖和葡萄糖醛酸相互转化、组氨酸代谢、抗坏血酸和醛酸盐的代谢以及吞噬体的代谢。具体而言，在有CaCO3的情况下，562个基因下调，262个基因上调，尤其是那些参与能源生产和转化的基因下调了26.7%。因此，CaCO3的不可替代性是由于其对PMLA代谢途径的影响而不是作为中和剂使用所致。最后，开发了添加CaCO3的联合pH偏移控制策略。发酵后，获得了64.8g/L的PMLA和38.9g/L的生物量以及无法检测的CaCO3和较少的CO2排放。

关键词：beta;-聚(L-苹果酸)；出芽短梗霉菌；中和剂；代谢途径

一、引言

beta;-聚L-苹果酸(PMLA)由酯键连接的L-苹果酸单元组成，由于其在医药等行业的潜在应用，引起了业界的兴趣（Arif et al. 2018; Israel et al. 2019; West 2017）。由于PMLA的生物合成，大多数菌株都能产生高浓度的PMLA (Cao et al. 2019; Manitchotpisit et al. 2011; Zou et al. 2016; 2019)。根据PMLA生物合成的pH控制(表S1)有两种模式：没有pH控制，或者使用可溶性碱或不溶性CaCO3进行pH控制。

在没有pH控制的情况下，PMLA的产量(6.9g/L)及其每细胞质量(Yp/x)(0.53g/g)都是最低的(Liu and Steinbuuml;chel 1997)。使用可溶性碱进行pH控制，据报道当pH为6.0 (Cao et al. 2013) 和pH为4.0(Liu and Steinbuuml;chel 1996)分别适用于PMLA和其中以10%的Na2CO3为中和剂，在pH为6.0下得到最高的Yp/x=0.73。当用30g/L的CaCO3维持培养pH控制在6.5左右时，PMLA的产生过程受到强烈刺激，生物量略有增加，此时的Yp/x=2.26 (Zhang et al. 2011)。曹等人也报告了类似的结果(Cao et al. 2016)。在进一步提高CaCO3浓度至65g/L时，王等人 (Wang et al. 2015)获得最高的Yp/x=17.73。因此，CaCO3可能是PMLA生产的最佳中和剂，这导致了最高的Yp/x和PMLA浓度(152.5g/L)(Wang et al. 2015)。然而，当加入CaCO3时，残留的CaCO3可以与细胞结合，从而阻碍细胞的利用 (Cao et al. 2016)，并且，在PMLA发酵和分离过程中积累了大量的商业无用的石膏。因此，需要避免在大规模生产PMLA时使用过多的CaCO3。

为了取代CaCO3并揭示CaCO3加入对PMLA生产的影响机制，曹等人在2016年发现在CaCO3的加入时pH和Ca2 浓度会加快PMLA的浓度变化。然而，与王2015年和邹2014年等人的报告相比，在pH为6.0时，Yp/x=0.73仍然太低。在王和邹的报告里提到，与没有CO2供应NaOH相比，Na2CO3作为CO2供体在pH为6.5时可以明显提高PMLA的滴定量，这也比另一个供体CaCO3有更大的优势，因为它具有水溶性的特性。后来，曹等人在2016年的研究表明，在以NaOH或Na2CO3为中和剂时，保持培养物pH在6.0左右时，PMLA的产生和细胞生长无显着性差异。邹等人在2014年的结果和曹等人在2016年的不同结果可能是由不同的pH培养条件造成的，因为碳酸的pka1是6.38。曹等人在2018年发现当pH低于6.38时不利于CO2在培养基中的溶解，因为这阻碍了Na2CO3作为CO2供体在pH为6.0下生产PMLA的过程。除pH外，离子强度可能是影响可溶性碱生产PMLA的另一个因素，这是迄今为止尚未研究的。事实上，据报道在琥珀酸生物合成过程中，当使用可溶性碱(即NaOH)代替少量可溶性MgCO3进行pH控制时，若电导率过高会对细胞有毒性 (Cao et al. 2018)。因此，为了进一步提高PMLA的产量，需要深入研究pH和离子强度的影响。此外，它还需要揭示CaCO3和可溶性碱对PMLA产生影响的分子机制，特别是使用全基因组转录组分析，这可以揭示不同条件下菌株表达谱的显著变化(Li et al. 2019; Sun et al. 2019a; b)。因此，分析不同中和剂生产PMLA的转录组和发酵特性，可以为提高PMLA的产量提供一些启示。在本文报道的研究中，为了进一步提高PMLA的产量，并取代或减少CaCO3的消耗，首先研究了pH控制和离子强度对PMLA生产的影响。此外，为了阐述离子强度对PMLA生物合成的影响，开发了一种结合发酵系统，它利用扩展床吸附(EBA)系统将PMLA发酵与原位分离相结合。然后，研究了CaCO3对PMLA产生影响的分子机制。 最后，将为PMLA的高产量生产开发一种有利的pH控制策略，以减少发酵后CaCO3的残留。

  1. 材料和方法
  2. 微生物，培养基，培养条件，分析方法

出芽短梗霉菌ipe-1 (CGMCC no. 3337)，培养条件，生产PMLA的培养基与曹等人在2012年所描述的相同。如曹等人在2019年所记录的那样测定了PMLA、生物量和糖。使用精确的气体分析方法检测氧气和二氧化碳的浓度(HiTec Zang, Germany)。PMLA产量(Yp/s)、细胞产量(Yx/s)、单位细胞质量比PMLA产量(Yp/x)、糖消耗率(SCR)和PMLA产量与曹等人在2019年所描述的相同。在中国苏州用GENEWIZ检测了出芽短梗霉菌ipe-1的基因组信息。利用生物导体R(V3.4.6)分析了微分基因。注释信息来自GO(http://geneontology.org/) 以及KEGG (http://www.genome.jp/kegg/)。同时，KEGG注释结果来源于KAAS(KEGG自动批注服务器)。

  1. 膨胀床吸附系统

EBA系统由7.5L生物反应器和EBA丙烯酸柱(高度35.5厘米，油管直径为4.0厘米)组成，通过蠕动泵的再循环功能连接。图S1显示了用D380树脂填充的两个阴离子交换柱的EBA系统的总体设置（中国天津南开大学化工厂）和一个阳离子交换柱填充0001times;7树脂（中国宁波正光树脂有限公司）。用30cm高树脂包装的EBA，用1mol/LNaOH溶液平衡阴离子交换柱或HCl溶液平衡阳离子交换柱，然后在吸附前用消毒水冲洗。在系统串联连接并通过加压无菌空气排出水之后，将培养基从生物反应器传递到EBA系统，然后再返回到生物反应器中。

对于使用两个阴离子交换树脂柱的原位吸附，它连续运行24h后，这两个柱将在48h后被另两个新鲜柱所取代。同时，EBA柱的洗脱和再生操作遵循上述标准单元操作。如上所述，测定了生物反应器中的PMLA。耦合过程中的最终PMLA浓度计算公式如下：

C(PMLA,f)=C(PMLA,e) (C(PMLA,24h)·V24h-C(PMLA,a)·V48h)/V(broth) （1）

其中C(PMLA，f)是生物反应器中的最终PMLA浓度(g/L)，C(PMLA，e)是生物反应器中的最终PMLA浓度(g/L)，C(PMLA，24h)(g/L)和C(PM

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