使用筛选得到的高产量菌株以提取剑麻的总皂苷以及其最优化的发酵条件外文翻译资料

 2023-01-10 16:11:35

使用筛选得到的高产量菌株以提取剑麻的总皂苷以及其最优化的发酵条件

Feifei ZHOU1，Zaibin HAO1，Dongmei LIAO2，Fei ZHANG1，Kexian YI3，Jinlong ZHENG3，Xiuli WANG1* 1． College of Chemistry and Bioengineering，Guilin University of Technology，Guilin，Guangxi 541006，China; 2． Guangxi Academy of Industrialization Engineering of Zhuang Medicine，Liuzhou，Guangxi 545200，China; 3． Environment and Plant Protection Institute，CATAS，Haikou，Hainan 571101，China

摘要：[目的]使用筛选得到的高产量菌株以提取剑麻的总皂苷以及其最优化的发酵条[方法]从附近桂林城市的山上采集得来的数百个土壤样本。JMZ-N06菌株根据筛选获得。通过使用JMZ-N06菌株从剑麻残留物中提取总皂苷。L9(34)正交试验进行与固液比，发酵时间、发酵温度和发酵液体的pH值等因素影响的实验。[结果]最佳提取工艺如下:1∶20固液比(每1L发酵液体50 g残留物)，发酵时间60 h，发酵温度32℃和发酵液体pH值6.0。[结论]JMZ-N06菌株和萃取技术都是稳定的，JMZ-N06菌株作为从剑麻中提取总皂苷的菌株是非常高产菌株。

关键词：菌株；总皂苷剑；麻发酵条件；正交试验

1介绍

剑麻是生产硬质纤维主要经济作物。在生产硬质纤维时，残留物中富含皂苷、果胶、叶绿素、纤维素和其他非常有用的材料。直接排放或堆积是一种资源浪费和严重环境污染[1]。剑麻中的皂苷有各种活性包括抗肿瘤，抗炎，抗菌、止血、抗衰老、肝保护和降糖效果[2 - 5]。因此，皂苷被广泛应用在食品、药品和保健产品。剑麻中的皂苷主要由葡萄糖和糖苷配基组成。图1说明了分子结构(R是葡萄糖)。5种单体结构为 A、B、C、D和E[6 - 8];平均相对分子量为209.8。

传统的从剑麻中提取皂苷的方法包括溶剂法、酸碱性沉淀方法，超声波萃取法、超临界萃取法和生物工程发酵方法。溶剂法的缺点是提取所得的有效成分少和纯度低，酸碱性沉淀方法因单相酸需要强大的水解条件，伴随脱水和结构性变化。超声波提取方法可以避免由于高温和高压对有效成分造成的损害，但对容器的壁厚和放置的地方有很高的要求。超临界提取方法具有良好的渗透性和很强的溶解能力材料，提取特定组份的效率高。然而，皂苷有很大的分子量和许多氢氧根和很强的极性，所以需要增加的压力和更多的溶剂来提高萃取率。生物工程发酵方法加速破坏植物通过添加细菌细胞壁释放有效成分应变[9]，因此可以减少提取困难和环境污染、减少劳动力、原材料和化学试剂[10]。

图1 剑麻皂苷的分子结构

2材料和方法

2 . 1材料

2.1.1菌株来源 数百个从附近桂林城市的山上采集得来的土壤样本。

2.1.2样品来源 从广西剑麻集团有限公司收集剑麻残留物。

2.1.3主要试剂 剑麻皂苷配基标准物质(98%，高效液相色谱纯)购自上海耿雁生中国生物技术有限公司;DNS试剂:262mL的2mol/L氢氧化钠是混合着6.30 g 3，5-二硝基水杨酸。然后，他们加入500毫升的溶液包含182 g酒石酸钠钾。5.00克苯酚和5.00克亚硫酸钠加入到溶液中，充分混合后，将这个溶液冷却到室温。添加蒸馏水，直到达到1 L的体积。最后，将溶液 存储在棕色试剂瓶室温保存10 - 15 天。

2.1.4培养基 PDA培养基:土豆200.00 g，葡萄糖20.00g、琼脂粉15.00克，加水至体积1 L。木聚糖培养基:土豆200.00 g，木聚糖20.00g，琼脂粉15.00 g，加水至1 L。检查板介质: NaNO33.00 g，K2HPO41.00 g ，MgSO4·7H2O 0.50g。 KCl 0.50g，FeSO4·7H2O 0.01g，木聚糖20.00g，琼脂15.00 g，加水至1 lL。摇瓶介质:NaNO3 2.00 g ，K2HPO4 1.00 g ，MgSO4·7H2O 0.50g，KCl 0.50g，FeSO4·7H2O 0.01g，木聚糖20.00g，加水至1 L .种子培养基:2 . 00 g NaNO3，K2HPO41.00 g，MgSO4·7H2O 0.50g、0。KCl 0.50g，FeSO4·7H2O 0.01g，葡萄糖3.00g，木聚糖2.00g，加水至体积1 L.酶生产培养基:葡萄糖5.00g，蛋白胨6.00 g，K2HPO41.00 g，MgSO4·7H2O 0.50g，KCl 0.50g，FeSO4·7H2O 0.01g，木聚糖20.00g，添加水至体积1 L。

2.1.5主要试剂. Cary50紫外-可见分光光度计从Varian Associates公司购买;SHZ-D(Ⅲ)真空泵从巩义市子华仪器有限公司购买;便携式高压灭菌器是购自上海华线医疗核子仪器有限公司;dzf - 6050真空干燥箱是购自上海逸恒科学仪器有限公司;lrh - 150 z(Ⅱ)微机控制振荡培养箱是购自广东医疗器械工厂。

2 . 2方法

2.2.1初步筛选的菌株。剑麻残留物在无菌水中浸泡24 h后。通过纱布过滤，滤液收集以备将来使用。10 g收集的土壤样本和包含100毫升残留物的滤液放入锥形瓶。摇瓶在160 r / min 30℃下培养24小时，收集5毫升土壤稀释剂进行离心。将上层清液涂在筛选平板上，以一个恒定的温度30℃培养。单一的菌落地被选出，进行二次筛选。

2.2.2二次筛选 从初步筛选获得的菌株在PDA培养基上进行纯化，添加到种子培养基，然后在30℃下培养32 h以备后续使用。

0． 00，0． 20，0． 40，0． 60，0． 80，1． 00，1． 20，1． 40 和1. 60 mL葡萄糖标准溶液(浓缩母液浓度1． 00 mg /mL)分别添加到25毫升比色管。并且将他们依次编码0 - 8 。添加蒸馏水，直到达到2． 00 mL；然后再加入DNS50毫升。在沸水中进行5min显色反应。冷却到室温后，加蒸馏水直至25毫升。充分混合后，在波长为540 nm发现OD540nm。得到还原糖X(mg)和光密度的回归方程。方程标准曲线是Y = 0． 128x － 0． 020，r = 0． 999 0 线性范围是10 - 70mu;g /mL。

2.2.3检测细菌对还原糖的发酵能力。30ml细菌溶液在4 500 r / min转速下离心15分钟。细菌收集和加入到含有2%木聚糖的PDA培养基。在一个恒定的温度下振荡培养48 h，在4 500 r / min转速下离心15分钟。然后，上清加入了还原糖的提取液。还原糖在提取液中含量用DNS方法进行检测。

2.2.4菌株的生长曲线的建立。以10%接种量的剂量、种子发酵液体接种到酶生产培养基中，培养3 d。在25℃、140 r / min条件下摇瓶培养。每2小时检测发酵肉汤OD560nm。发酵肉汤的光密度、细菌和生物质建立相关曲线。

2.2.5剑麻皂苷标准曲线的建立。剑麻皂苷标准曲线的建立:5.00 mg剑麻皂苷的标准物质重，用5ml甲醇溶解。然后0.2，0.4，0.6，0. 8 和 1.0 mL溶液分别加入25ml，空白管作对照，试管被烤至70℃，然后冷却至室温，以供将来使用。0.2毫升5%香草醛冰醋酸和0.8ml高氯酸依次添加。充分混合，将溶液在70℃烤箱加热15分钟。溶液取出后，立即用流水冷却至室温。然后，5毫升冰醋酸加入。充分混匀后好，在波长为450nm处检测OD560nm。以含量为x轴和光学密度为y轴，建立标准曲线。

2.2.6总皂苷的提取条件的优化从剑麻高产菌株发酵的。四个因素是选择固液比，发酵时间、发酵温度、发酵液体的pH值。皂苷含量残留检测，以找出最优发酵条件[11-14]。

(1)固液比对剑麻总皂苷的提取速度的影响。活化后，30毫升细菌液体种子用于离心20分钟。然后，沉淀细菌被100毫升无菌水稀释。稀释细菌溶液转移到八管，分为两组，每组四个试管。细菌灭活组1和四管作为控制。5、10、15、20 g残留的剑麻添加分成两组;和管编码为1 - 4和5 - 8日。在160 r / min摇动培养48h后，5毫升浓度液体发酵进行了4 500 r / min 15分钟。提取100mu;L上清液涂抹收集，编码为1 - 8。在真空干燥箱进行干燥。同样的流程进行皂苷的检测。

(2)发酵时间对剑麻总皂甙萃取率的影响。活化后，30毫升细菌液体种子在500 r / min用于离心20分钟。然后，沉淀细菌收集以备将来使用。5 g残留的剑麻加入100ml无菌水，细菌转移到残留溶解液。在160 r / min摇动培养后28℃，5毫升发酵液体在12，24，36，48， 60和72 h收集5毫升发酵液体。在4 500 r / min 离心15min。提取100mu;L上清液真空干燥。同样的流程进行了皂苷的检测。

(3)发酵温度对剑麻总皂甙萃取率的影响。活化后，30ml细菌液体种子在500 r / min离心20分钟。然后，沉淀细菌收集以备将来使用。5 g残留的剑麻加入100ml无菌水，细菌转移到残留溶解液。在160 r / min离心培养 48h，在24、 26、28、30、32和34℃提取。5ml发酵液体在4 500 r / min 离心15分钟。收集100mu;L上清液真空干燥。同样的流程进行了皂苷的检测。

(4) 发酵液的pH值对剑麻总皂苷的提取率的影响。活化后，30毫升细菌液体种子在500 r / min离心20分钟。然后，沉淀细菌收集以备将来使用。5 g残留的剑麻加入100毫升无菌水，细菌转移到残留溶解液。液体发酵的pH值调整到3、4、5、6、7和8。离心培养在160 r / min 28℃离心培养48小时。5毫升液体发酵为离心收集4 500 r / min 15分钟。收集100mu;L上清液真空干燥。同样的流程进行了皂苷的检测。

(5)正交试验的设计。根据单因素试验结果，四个因素是选择，固液比(A)，发酵时间(B)，发酵温度(C)和pH值的发酵液体(D)。L9(34)正交试验。与剑麻总皂苷的提取量从调查指数提取技术优化[15 - 16]。表1表明的是因素和水平。

3结果与分析

3 . 1获得JMZ-N06应变

图2说明了短杆形光学显微镜下，在平板培养，菌落光滑。在透射电子显微镜下无鞭毛。透射电子显微镜下的长宽比2∶1。

图2左边是平板上的菌落;中间是1.0times;103光学显微镜下，右边是5.0times;104透射电子显微镜下

3 . 2二次筛选

表2显示该菌株有相对高的木聚糖降解能力。结果表明这株木聚糖降解加速的剑麻皂苷为单糖，有利于剑麻皂甙释放和提高提取率。因此，该菌株值得进一步研究。

图3 菌株的生长曲线

3 . 3菌株的传播

细胞生长曲线是一个重要的指标来确定细胞生存能力，以及细菌生物学特性的基本参数之一。在给定的波长下，细菌溶液的光密度和细菌的数量正相关。图3所示的光密度是最大的种植时32 h;细菌生长在对数期，活动在液体发酵是最大的;和代谢活动是最有力的。

3 . 4剑麻皂苷标准曲线

剑麻皂苷的标准曲线方程= 1.416 x 0.042 7并且 r = 0.9990，表明有良好的线性关系的范围为0.1 – 0.7mg/mL。根据五个单体皂苷的结构，它可以计算出剑麻总皂苷的分子量为209.8。换句话说，光密度和总皂苷量的方程是M = ( y－0.042 7) times;2. 90 /1.4160。

3 . 5固液比对剑麻总皂苷的萃取率的影响

图4显示，在给定的接种细菌，皂甙的提取速率显著增强时，剑麻残留的重量增加1 - 5 g。然而，当残留的重量大于5克，总皂苷的萃取率逐渐减少，重量增加。

图4固液比对剑麻总皂苷的萃取率的影响

3 . 6发酵时间对剑麻总皂甙萃取率的影响

图5显示，发酵时间是12 - 48 h时，剑麻皂甙萃取率随着发酵时间的延长而增加， 48 h后略有减少。因此，可以得出结论，萃取率最大的发酵时间是48小时。

图5发酵时间对剑麻总皂甙萃取率的影响

3 .7发酵温度对剑麻总皂苷的提取速度的影响

图6表明，剑麻总皂苷的提取速度随发酵温度增加而增加。达到一定温度后，总皂苷的萃取率随温度提高而下降。

图6发酵温度对剑麻总皂苷的提取速度的影响

3. 8发酵液的pH值对剑麻总皂苷的提取率的影响

图7表明， 液体发酵的pH值为5.0时，萃取率最大， pH值大于5.0时，剑麻总皂苷的提取率迅速减少。

图7发酵液的pH值对剑麻总皂苷的提取率的影响lt;

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