丝状不放氧光合细菌Roseiflexus castenholzii中一种蓝铜蛋白（金色蓝素）的鉴定分析外文翻译资料

 2023-01-10 16:12:18

丝状不放氧光合细菌Roseiflexus castenholzii中一种蓝铜蛋白（金色蓝素）的鉴定分析

原文作者：Yusuke Tsukatania, Nahomi Nakayamab, Keizo Shimadab, Hiroyuki Minoc, Shigeru Itohc,Katsumi Matsuurab, Satoshi Hanadaa, Kenji V.P. Nagashimab，

单位：

a Institute for Biological Resources and Functions, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), Tsukuba, Ibaraki 305-8566, Japan

b Department of Biological Sciences, Graduate School of Science, Tokyo Metropolitan University, Hachioji, Tokyo 192-0397, Japan

c School of Material Science (Physics), Graduate School of Science, Nagoya University, Nagoya 464-8602, Japan

摘要：本文报道了对丝状不放氧光合细菌Roseiflexus castenholzii中的一种蓝铜蛋白金色蓝素（auracyanin）的纯化和鉴定工作。基因组序列的分析表明在R. castenholzii中只有一中auracyanin，然而在同属模式物种Chloroflexus aurantiacus中已确认有两种auracyanin，分别称为auracyanin A和auracyanin B。Roseiflexus 的auracyanin的吸收光谱类似于C. aurantiacus中的auracyanin B的吸收光谱。另一方面，Roseiflexus 的auracyanin的电子自旋共振波谱却与C. aurantiacus中的auracyanin A的波谱相似。这些结果表明R. castenholzii中的auracyanin具有与auracyanin A和auracyanin B的共同特征。各种丝状不放氧光合细菌中的auracyanin的氨基酸序列比对结果也证明Roseiflexus 的auracyanin具有嵌合的结构特征：一级结构的氨基端类似于auracyanin A，而羧基端序列具有类似于auracyanin B的单残基间距的铜结合环区。

关键词：金色蓝素 蓝铜蛋白 丝状不放氧光合生物 反应中心 Roseiflexus

引言

丝状不放氧光合细菌（FAPs，旧称为绿色非硫细菌或绿色丝状细菌）通常生存于热温泉中，形成菌垫进行繁殖。此类细菌属于绿弯菌门，在包括六个门的光合原核生物的16S rRNA进化树中位于最早出现的分支谱系中。探索FAPs的光合反应机制对于阐明光合作用的早期进化历程具有重要意义。然而，对于FAPs的光合体系和电子传递过程还知之甚少。原因包括针对这类细菌的遗传操作体系的缺少、基因组信息的匮乏以及物种数量的限制。在超过二十年的时间里FAPs都被认为只有一个嗜热生物种Chloroflexus aurantiacus，直到Hanada及其同事从日本的热温泉中又发现了FAPs的两个新种：Chloroflexus aggregans和Roseiflexus castenholzii。

丝状不放氧光合细菌的反应中心复合物类似于紫色光合细菌中的，与植物及蓝细菌的光反应系统II同属于一类称为类型-2的反应中心复合物。紫色细菌中光合能源的转换过程以循环电子传递为基础，是由膜中的醌类化合物、细胞色素bc复合体和可溶性的电子载体（如细胞色素c2）与反应中心复合物一起合作完成的。光合循环电子传递过程形成跨膜的质子动力势用来合成ATP。然而，在FAPs中，除了反应中心复合物之外的其他光合电子传递链的成分还没有被完全研究清楚。尤其是细胞色素bc复合体和可溶性细胞色素c都没有在生物化学或分子生物学研究工作中被发现。

不同于可溶性细胞色素，有两种类型的蓝铜蛋白已经在C. aurantiacus中被发现和命名为auracyanin A和auracyanin B。Auracyanin A具有一个N端信号肽区、一个富含甘氨酸的连接区以及一个结合铜离子的可溶性区域。这个可溶性区域通过连接区的第一个半胱氨酸残基的甘油脂肪酸酯而锚定在细胞质膜上。相比之下，Auracyanin B的N端含有一个跨膜螺旋区域，由此把的C端可溶性含铜区域与质膜相连。C. aurantiacus中的auracyanin A和auracyanin B可溶区域的晶体结构表明其结构与细菌蓝铜蛋白和天青蛋白有同源性。尽管缺少直接的证据，Auracyanin蛋白被认为是C. aurantiacus反应中心复合物的电子供体。

因为C. aurantiacus含有被称为chlorosome（绿小体）的特异的捕光天线构造，其强大的光吸收和荧光发射特性会严重干扰利用光谱学方法来进行各种电子传递组分的闪光诱导吸收变化的研究工作。由于最近发现的R. castenholzii自然缺少chlorosome，非常适宜于作为研究FAPs中的光合电子传递过程的模式生物。虽然已知R. castenholzii含有一个类型-2的由L、M和细胞色素C亚基组成的反应中心，但是还为确认R. castenholzii是否也具有像C. aurantiacus一样的auracyanin蛋白。

基因组测序项目显示在R. castenholzii基因组中有一个开放阅读框编码推测的含铜蛋白。在本研究中，我们克隆了该基因，并且在大肠杆菌中进行了过表达。进而纯化获得了产生的蛋白质，并且与C. aurantiacus的auracyanin A和auracyanin B进行了比较分析。结果表明，R. castenholzii中的蓝铜蛋白具有类似auracyanin A和auracyanin B的分子特征。

材料和方法

编码蓝铜蛋白基因的克隆

Roseiflexus castenholzii 菌株HLO8 (DSM 13941)在50℃下的PE培养基中进行光合生长方式培养。基因组DNA主要依据联合基因组研究院（JGI）提供的方法进行提取。R. castenholzii基因序列信息的建立主要是通过与宾夕法尼亚州立大学的Bryant博士及JGI的Raymond博士合作来完成的。目前基因组的信息已经可以从JGI的DNA数据库中获得。通过聚合酶链式反应（PCR），以分离的R. castenholzii 基因组DNA为模板，其中一个编码auracyanin可溶性区域的DNA片段被扩增。使用的引物为RAu-F5 (50-GGGCATATGACAACGATCGAGATCGCG; 下划线为NdeI酶切位点)和RAu-R1 (50-TTTTGGATCCTCACGGCGCGACCGTCAT; 下划线为BamHI酶切位点)。扩增后的片段采用NdeI和BamHI进行双酶切之后克隆到pET15b质粒上。然后将形成的重组质粒pET15b-RAcore转化到BL21(DE3)感受态大肠杆菌菌株中。

异源表达的金色蓝素蛋白的纯化

氨基端有组氨酸标签标记的重组auracyanin在大肠杆菌中进行了过表达，通过1 mM的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）在25℃下进行诱导表达15 h。在收获大肠杆菌细胞之前，对在生长大肠杆菌的培养基中加入0.25 mM硫酸铜并且孵育30 min。收获后的大肠杆菌细胞悬浮在孵育缓冲液中（20mM Tris-HCl，pH 8.0，250 mM NaCl，5 mM咪唑）进行细胞的超声波破碎，并采用10000times;g离心15 min。离心所得的上清液与组氨酸选择型树脂（Sigma-Aldrich，USA）进行混合，表达蛋白的分离根据制造商提供的操作方法进行。经过亲和层析纯化获得的富含组氨酸标签的auracyanin组分再进行透析，透析液为含有0.25 mM 硫酸铜的20 mM Tris-HCl，pH8.0缓冲液。蓝色的auracyanin蛋白组分用截止量5000的超滤管（Viva-spin，Sartorius，德国）进行浓缩，然后用凝血蛋白酶（Novagen，美国）进行处理去除组氨酸标签，然后上样到20 mM Tris-HCl，pH8.0缓冲液平衡后的阴离子交换柱（DEAE-Toyopearl 650M）进行层析纯化。采用50 →100 mM NaCl进行梯度洗脱，获得蓝色的auracyanin蛋白。在组氨酸标签被切除之后，来源于pET15b质粒上的四个残基GSHM位于重组auracyanin的氨基端。吸收光谱、氧化还原滴定及闪光光解实验材料是去除标签后的auracyanin，但ESR波谱测量的材料是有组氨酸标签的auracyanin融合蛋白。

SDS-PAGE分析和蛋白质测定

SDS-PAGE分析采用Laemmli方法进行。电泳之后，蛋白质条带用考马斯亮蓝进行染色。

光谱分析

采用U-1900分光光度计（日立，日本）进行吸收光谱的测定。样品悬浮液是10 mM MOPS-NaOH，pH 7.0。

氧化还原滴定使用U-1900分光光度计进行，方法参考文献15。10 micro;M的auracyanin蛋白样品悬浮在10 mM MOPS-NaOH，pH7.0缓冲液中。测量中使用的氧化还原调节剂是50 micro;M Fe-EDTA和20micro;M DAD（四甲基对苯二胺）。悬浮液使用氮气进行脱氧处理。氧化滴定剂和还原滴定剂分别为铁氰化钾和抗坏血酸钠。

ESR波谱采用配备有标准共振器（TE102）和气流温度控制系统（CF935:牛津仪器）的Bruker ESP-300 EPR光谱仪进行记录。

结果

R. castenholzii编码蓝铜蛋白的基因

简单的tBLASTn分析显示R. castenholzii基因组中有一个基因，其序列与C. aurantiacus中的auracyanin A和auracyanin B序列显著相似（图1B）。从位点编号Rcas3112的基因推断出的氨基酸序列与auracyanin A有51%的同一性和65%的相似性，与auracyanin B有41%的同一性和60%的相似性。用auracyanin A或auracyanin B的基因作为输入参量进行BLAST查询，结果显示出R. castenholzii包含一个编码auracyanin的基因，即使E值的阈值设定为小于10-2。相同分析显示Chloroflexus属的两个种（C. aurantiacus和C. aggregans）中存在两种auracyanin蛋白。

R. castenholzii推测的金色蓝素基因的表达和纯化

R. castenholzii的auracyanin有一段N端多肽序列，具有细菌脂蛋白信号肽序列的特征。与auracyanin A中的情况相似。随后的“连接器”区域富含甘氨酸。连接区域的第一个氨基酸残基是半胱氨酸残基，它被修饰成乙酰基- N-半胱氨酸-S-甘油形式，可能用来锚定于质膜上。富含甘氨酸的连接区域的氨基酸残基在Auracyanin A的晶体结构中是无序的。连接区域可能像系绳一样把可溶性区域连接在膜上，并可在细胞周质空间中来回摆动。在本研究中，我们克隆了编码可溶性区域的DNA片段（159个氨基酸残基中的122个）。在预实验中，从SDS-PAGE和吸收光谱（数据未展示）的结果来看，带有pET15-RAcore重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)菌株可以产生大量的脱辅基蛋白和少量的全蛋白。随后我们对实验过程进行了优化，包括用含有0.25 mM硫酸铜的缓冲液对脱辅基auracyanin蛋白样品进行透析处理，从而获得大量的亮蓝色的全蛋白，这些全蛋白在600 nm附近有典型的吸收峰。这些蓝色的全蛋白样品通过DEAE离子交换柱进行进一步的纯化，并且通过50 -100 mM NaCl的梯度洗脱（细节请参考“材料和方法”）。

如图2所示，纯化的auracyanin蛋白质在SDS-PAGE凝胶中呈现为单一条带。从SDS-PAGE分析的结果来看，

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