用于发现昆虫病毒的新一代测序技术外文翻译资料

 2023-01-10 16:14:57

用于发现昆虫病毒的新一代测序技术

原作者：Sijun Liu, Diveena Vijayendran and Bryony C. Bonning

单位: Iowa State University

摘要：昆虫通常会感染多种病毒，包括那些引起亚致死的，无症状表现的，和潜伏感染的。通常传统的用于病毒分离的方法，检测此类病毒是否存在的灵敏度较低。在这方面，新一代测序技术已经彻底改变对昆虫新病毒的发现和识别方法。我们在这里讨论发现病毒的传统和现代方法，以及概括测定小分子RNA序列的数据分析。我们将从头介绍病毒序列，从BLAST数据电位病毒序列的鉴定，以及用于产生全长或接近全长的病毒基因组的序列的生物信息学的装配方法。我们还将讨论病毒在昆虫和昆虫细胞系中无处不在的影响。本文中介绍的所有方法也适用于病毒在其他生物体中的发现。

关键词：昆虫病毒 ; 新一代测序; 病毒发现; 小分子RNA; 转录

  1. 简介

病毒可以在当前任何一个生命体中被发现并且可能是地球上最丰富多样的生物实体 [1, 2, 3]。除了增加对病毒多样性的演变的理解，可以引出与昆虫病毒有关的以下方面：（一）保护受病毒感染的益虫（如蜜蜂 [4] 、丝绸飞蛾、家蚕）（二）实际应用于昆虫病毒在昆虫中的传播，包括入侵物种（例如各种鳞翅目害虫，包括苹果蠹蛾，苹果蠹蛾林奈和黎豆毛虫，棉铃虫[5]）（三）识别该矢量病毒对人类，动物和植物健康的影响[6]。（四）使用昆虫病毒如用于蛋白质表达或基因沉默，和多种用途的类病毒颗粒的适应[7,8]。与典型的病毒病原体视图相反，病毒也可能与它们的宿主有互惠和共生的基本利益关系[9]。例如，多分DNA病毒是寄生蜂在寄主昆虫体内生存与发展所必需的[10]。一浓核病毒曾被报道具有决定寄主蚜虫翅膀形态的功能[11]。噬菌体会感染蚜虫兼其共生细菌，保护发展中的黄蜂免遭寄生在豌豆蚜中的烟蚜的攻击[12,13]。

传统上，病毒可以从结果显示的异常表型病毒感染的昆虫中分离。一些感染病毒的昆虫，如杆状病毒，结果具有清晰的症状与宿主的最终死亡，许多病毒感染无症状。在最近几年，随着新一代测序（NGS）技术的发展，明显无症状或隐蔽的病毒感染是普遍存在的。这些病毒会积累相对低效价在宿主生物体（即慢性感染），或成为潜在的，使得病毒生产完全停止。这些病毒也不会容易地通过传统的被检测协议病毒方法被发现。

NGS的使用在过去的五年中彻底改变了微生物和病毒的发现，该技术快速、廉价、高通量和用于从整个昆虫或特定组织中衍生的病毒序列的鉴定准确的测序，并为存在于低效价不会导致在宿主症状的病毒。NGS也被用于病毒监视，例如节肢动物传播的病毒[14]。

2. 传统方法对病毒的发现

第一个被发现的病毒是烟草花叶病毒(TMV)由Dmitri Iwanowsk发现, 1882年，俄罗斯植物学家。他表明,从患病烟草植物提取物可以传播疾病后其他植物通过陶瓷过滤器,足够可以保留细菌。后第一个病毒颗粒(TMV)观察电子显微镜的发明于1931年。从1930年代虽然知道病毒是由蛋白质外壳和核酸,方法检测病毒蛋白和病毒基因组RNA或DNA并不发达,直到1970年代末和1980年代初。昆虫病毒的发现传统的方法是收集来自多个种群从多个位置,和使用的材料至少几微克。

病毒纯化协议各有不同,但材料一般均为在无菌条件下离心和过滤。进一步净化可能包括超速离心法和蔗糖或氯化铯梯度步骤。样品可能会被用于可视化病毒粒子的电子显微镜,感染昆虫细胞培养,观察细胞病变效应[15 - 17],通过喷洒和感染的昆虫,注射或口服接种完成科赫法则。病毒将被识别和进一步的特点是使用血清学方法和核酸杂交(特定的抗血清或探测可用),分子克隆和基因组测序[18]。使用细胞系是有益的,因为它允许文化和放大的病毒引起急性或隐性感染的主机。然而,缺乏适当的昆虫细胞系对这种病毒是一种常见的限制因素,不能认为所有的病毒在昆虫会复制在一个给定的细胞系。

2.1 电子显微镜

电子显微镜(EM)仍然是对病毒发现的最重要的一个技术[19]。事实上早期的形态学分类的病毒严重依赖病毒衣壳。使用EM的主要优势之一是生物病毒或病毒特定的试剂不需要鉴定。虽然家庭以外的识别病毒的水平是不可能的,他们提供了对病毒带来的更详细的描述。除了他们提供的通过分子手段检测的重要存在病毒序列。使用EM一个额外的好处是,样品未存储的情况下,不允许病毒分子检测用于快速EM可视化的病毒。有许多昆虫病毒的例子描述了EM发表文献,没有进行进一步的表征[20]。后续研究表征同一寄主的病毒昆虫通常无法参考旧文献的电子显微图[21,22]。在某些情况下,初始分类基于形态学,随后修订基于分子信息。这是白斑综合症病毒的虾,最初被认为是一个杆状病毒 (图1) [23]。用于电磁分析病毒样本的观察范围从粗略的提取纯化的病毒样本通过超速离心法和蔗糖或氯化铯梯度。薄切片的组织也普遍应用于观察昆虫病毒的组织取向。病毒颗粒的检验、标本放置在网格,通常受到负染色[24]。常用的消极的污点是醋酸双氧铀0.05至2%,1 - 2%磷钨酸(PTA),钼酸铵和0.05至5%。Immuno-electron显微镜(IEM)[25],它使用病毒检测的抗体病毒反应EM最早于1941年研制成功[26]。IEM,病毒与病毒抗血清在溶液中混合,形成一个复杂或immunoaggregate病毒抗体。这种抗体涂层可以负染色和杰出的病毒粒子。Immunolocalization用于观察病毒在薄切片组织标本和专门识别已知的病毒。病毒是涂有病毒抗体其次是二级抗体和胶体金结合网格中的(黄金标签)。网格为负染色。

图1 2011年病毒, 1852。透射电子显微图的包膜杆状病毒的核衣壳(Autographa californica nucleopolyhedrovirus;Baculoviridae)。插图:病毒粒子的白斑综合症病毒(种;Whispoviridae)的虾。基于形态学,最初认为是杆状病毒。TEM 的Hailin Tang。

2.2 血清学方法两种血清学方法

通常用于病毒检测酶联大衣或其他病毒蛋白质检测特定病毒的存在从样品总蛋白提取纯化的病毒或从受感染的昆虫或组织。ELISA和免疫印迹广泛用于检测已知病毒,也可以用来评估一种新的病毒的血清学关系已知的病毒在同一个家庭。

2.3 标准分子核酸杂交方法

用于识别病毒(污点南部、北部污点和点污点),但这些方法也依赖先验知识的目标病毒,病毒特异性核酸杂交的探针标记目标病毒DNA或RNA病毒的存在。聚合酶链反应(PCR)和逆转录聚合酶链反应(rt - PCR)是用来放大病毒DNA或RNA分别全长基因序列或部分。由此产生的DNA、cDNA片段克隆到向量和用于排序,和在全长序列的情况下也可能被用于筛查传染性病毒克隆[27]。比较序列数据对于一个给定的已知病毒的病毒将指示病毒是否小说或类似于已知病毒,并促进病毒分类和系统发育分析。

2.4 EST库

几个昆虫病毒被发现通过分析表达序列标签(EST)库。EST库是由孤立昆虫的总RNA和净化mRNA生成。

测序cDNA图书馆，因此est序列(通常是500 – 800nt),代表转录基因的序列。净化的mRNA生成cDNA图书馆需要选择的RNA,包括聚(背面polyT列,从而限制与聚(反面病毒rna序列表示。虽然相对较低的小病毒序列覆盖提供了est序列,可能有足够的序列5获得完整的基因组序列。鉴于EST库提供的序列覆盖率低,病毒检测通过EST序列可能是有限的,出席高滴度的病毒在宿主昆虫水手等。[28]发现六个est假定的病毒起源的cDNA文库来源于红火蚁,火红蚁,造成重大经济损失在美国三个est序列表现出显著的同源性急性蜜蜂麻痹病毒(Dicistroviridae)和5 被用来描述整个病毒的基因组序列,火红蚁病毒1(SINV-1)，Hunnicutt等。[29]孤立Homalodisca coagulata virus-1(HoCV-1)以下检测病毒序列的EST库glassy-winged神枪手,H . vitripennis(也称为H coagulata)[30]。介绍了昆虫从美国东南部到加利福尼亚在1980年代末,结果造成了大破坏的杂食性和缺乏天敌寄生蜂和昆虫病原真菌等。此外,h . vitripennis向量细菌Xylella fastidiosa,从而对许多植物物种造成负面影响。从这个分离的病毒昆虫可能潜在的用于管理。序列来自phytoreovirus(植物病毒)也发现从一个h . vitripennis唾腺cDNA库[31]。Oliveria等。[32]发现三个小说小RNA病毒(NvitV-1,2和3),最长的重叠群(即。一系列重叠的DNA序列,用来重建的原始序列)2789元(NvitV-1;不包括聚)寄生黄蜂,Nasonia vitripennis,EST库的数据挖掘。

2.5微阵列

芯片的使用提出了基础进行检测和检测的病原体[33]。DNA芯片平台设计中包括所有的全长序列的病毒基因,包括最高度保守的70 mer序列从每个完全参考病毒基因组测序。微阵列基因分型结果是用于病毒和病毒的发现。除了识别病毒出现在一个示例中,杂交病毒序列是孤立点的微阵列,放大了PCR、克隆和测序鉴定的新型病毒[34]。数组的组合杂交之后直接病毒序列恢复允许快速鉴定小说的病毒。芯片没有被改编为无脊椎动物病毒的发现,但提供了一个替代方法;例如,一个节肢动物病原体芯片用于检测已知病毒的(但不是发现)蜜蜂[35]。

3所示，下一代测序病毒发现下一代测序non-Sanger-based和高通量方法[36]允许生成数百万的序列[37]。多种高通量测序技术已经开发[38-40]。最常见的门店平台是罗氏454焦磷酸测序(454生命科学),Illumina公司(Solexa)测序,测序和固体(ABI生物系统公司)(表1)。

表1 比较最常用的下一代测序平台

3.1 样品和文库制备

样本库制备病毒序列可以提取昆虫分离出的总DNA(仅供DNA病毒)或RNA[41]。另外,病毒DNA或RNA提取之前,病毒净化可以消除寄主受到的核酸污染,其次是提取病毒DNA或RNA[42]。从现场收集的昆虫与RNA存储在理想情况下应迅速使用RNAlater(试剂盒)或试剂盒(表达载体)处理,DNADNAzol(表达载体)需在minus;80°C处理以后。然而,昆虫病毒RNA和DNA等也可以有安全稳定的存储解决方案:当病毒RNA和DNA在室温条件下是稳定的,建议样品保持冷藏。另外,昆虫可以直接存储在minus;80°C,尽管一些RNA病毒(如一些dicistroviruses)对冻融稳定。根据文库准备用于不同平台的测序。试剂、工具和方法准备库可以获得相应的公司。一般来说,有三种类型的库,最有用的病毒中发现的DNA、RNA(包括转录组)和RNA库。转录组测序,使RNA提取总RNA polyT治疗或核糖体RNA损耗方法用于文库建设前[14]。程序库的准备通常包括DNA或RNA碎片(DNA和转录组测序),片段的大小选择,添加适配器PCR和rt - PCR(转录组和小核糖核酸库),和序列的扩增。文库建设后,进行测序。

3.2 生物信息学分析

没有标准方法分析NGS产生的序列[43],虽然开发了大量的生物信息学方法和管道是由生成的数据集的具体挑战[44]。例如,大大简化了数据分析的一个参考基因组的对齐和比较挥动序列。一般来说,最初的原始测序数据(读取)处理程序提供的制造商为基本要求,删除适配器序列(适配器通常是低质量的5 端)和删除。小分子RNA序列的3 端适配器修剪等customer-developed项目或项目Cutadapt[45]这是免费的。不同的研究者有不同的方法用于数据挖掘发现病毒序列DNA或转录组序列数据可以用来进行爆炸基本局部比对搜索工具搜索(blastx、tblastx或blastn[46]与NCBI冗余(nr)数据库,或病毒数据库读取组装前[35]。达到病毒序列的读取给定E-values提取并用于新创组装。许多程序可用短内容汇编[40]和可用于新创组装或映射读取已知病毒基因组。对于小RNA序列数据,读取可能从头组装,然后叠连群用于爆炸分析找到同源病毒序列。与病毒性序列重叠群可能提取并重组作进一步鉴定。生物信息学方法用于病毒发现门店总结了数

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