一种瞬变钠电流诱导脊椎动物再生的研究外文翻译资料

 2023-01-10 16:15:06

一种瞬变钠电流诱导脊椎动物再生的研究

Ai-Sun Tseng,1,2,3,4 Wendy S. Beane,1,2 Joan M. Lemire,1,2 Alessio Masi,1,2 and Michael Levin1,2,3,4

1Department of Biology and 2Center for Regenerative and Developmental Biology, Tufts University, Medford, Massachusetts 02155, and 3Forsyth Institute and 4Harvard School of Dental Medicine, Boston, Massachusetts 02155

像青蛙这样的两栖动物在发育过程中自身可以修复受损的器官，包含其眼部的晶状体以及它的尾巴，通过生物学疗法进行器官修复，必须要对自然再生有详细深刻的理解。近年来，离子迁移已经牵涉作为再生的功能调节器，而电压门控性钠通道在传播中的重要作用表现在可兴奋细胞中产生的动作电位。我们已经确定再生主要由介导离子转运功能的电压门控钠通道控制，NaV1.2为离子转运功能调解。非洲爪蟾胚胎尾部切除后细胞内早期增长的钠离子对尾部再生是必须的，分子与药理学研究还发现对钠离子抑制后会导致再生的失败。NaV1.2在不可再生的状况下是不存在的，然而人类Nav1.5在错误的表达下却能在这种状态下使其再生功能恢复。值得注意的是，瞬间产生的钠电流的药理感应能够在非再生伤口上皮形成后恢复再生，确认它是钠转运调节并且是用于再生的关键点。我们的研究揭示了其中细胞保持其固有的再生程序，以前未被发现的功能，确定一个新的内源性作用,并且表明钠转运的调节代表着一个新型的器官修复途径。

  1. 引言

人类自身对于修复受伤或者损坏的器官能力有限。有趣的是，大多数哺乳动物器官中含有常驻的原始细胞（zupanc，2006），但至今还未知这些细胞为什么没有被动员起来进行修复，假设可能缺乏一个指导性的信号。最近，生物物理信号已经变得清晰，如离子电流和图案化的电压梯度，（Reid et al., 2005; Adams et al., 2007）是再生的诱导和结构中新组织的形成重要组成部分。例如，两栖类动物四肢及哺乳动物组织角膜（Zhao et al., 2006; Adams et al., 2007）为了在分子基础识别在再生中的再生电流，我们用非洲爪蟾 – 一个强大的模型，在它的幼虫时期能够完全修复它损伤的肢体，使用的途径是保护哺乳动物使其再生，如哺乳动物，通过组织重生和分化转移（Gargioli and Slack,2004; Slack et al., 2004; Chen et al., 2006）

非洲爪蟾幼虫尾部是一个复杂的器官，包含有多种细胞类型：肌肉、周围神经、脊髓、脊索，皮肤、血管。在尾部截肢，伤口在截肢后6–8 h内愈合（HPA）。在24 HPA下，前体肿胀的原始细胞，称为再生芽，在受伤部位形成。随后，组织产物和模式结构开始为尾重生持续7天（Beck et al.，2009）

几种分子成分对于尾部再生的调节已经被证实。TGF-的信号对于适当的伤口愈合是必须的，并且在截肢后早期的15分钟被检测 (Ho and Whitman, 2008) （氢）质子泵，ATP酶，在截肢后6小时活跃，及它的潜在的跨膜调制是必须的，在最初的24HPA芽细胞再生期间。细胞凋亡在胚芽再生的最初24 HPA中也是必须的。信号通路的组成部分，例如BMP、Notch、Wnt和FGF被表达后 随后参与到驱动再生产物和模式中，综述及其特征，轴向发展中的角色。在非再生组织状况下，有一些方法途径已经有针对性地诱导脊髓再生。现如今，所有这些功能介入到并应用在受到实际伤害前。然而，为了再生医学领域进一步重大的发展，发现并证明一种新途径，它可以有针对性通过治疗损伤，并促使肢体再生和感染的伤口愈合。

这里，我们证实了一个新的机制，通过调节控制脊椎动物再生在活跃的钠离子转运中，由内源性电压门控钠通道介导的，其中NaV1.2是关键，钠转运的直接调制有能力使在非再生的伤口上皮形成诱导脊椎动物再生。我们的数据揭示了一种新的再生生物调节剂，并提出了一种新的独立的转基因治疗方法，它能促使一个复杂的附属器官和肢体再生。

  1. 材料和方法

尾再生实验。经批准协议非洲爪蟾幼虫培养（实验动物护理和使用委员会# m2008-08）。

在（St）40 - 41（再生）或45 - 47（周期）阶段（Nieuwkoop和Faber，1967）肛门和尖端中点之间被截肢。小蝌蚪在22°C 0.1times; MMR进行培养，或没有试剂中培养7天，并取得了尾部再生。此外表明，250 um MS222（Sigma）是比较用于检测量化和不同试剂处理蝌蚪组再生能力，我们确定了复合再生指数（RI），此前所描述的这个指数范围从0（无再生）到300（完全再生）（Adams et al., 2007）。以及具体的定义再生表型类（充分，好，弱，没有）补充图S1（可在www.jneurosci.org作为补充材料）。例如，在其中一组尾巴完全再生大于80%将有一个复合再生指数，范围从240到300；如果完全再生发生在小于10%的动物组内，复合再生指数范围将从0到30。

RNA干扰和胚胎注射。DNA序列编码短发夹RNA（shRNA）针对非洲爪蟾Nav1.2（ay121368）、红色荧光蛋白（ay679106），或盐诱导激酶（SIK; 1319975)）克隆下游一个U6 RNA聚合酶III启动子；载体还包含巨细胞病毒驱动下的绿色荧光蛋白（GFP）（(Miskevich et al., 2006)）。RNA干扰（RNAi）靶序列如下：Nav1.2，5-gccatggagcattatccaatg-3；红色荧光蛋白，5-gttcaagtccatctacatggc—3；最后，5-gccagttctctactcacaaac—3，这些结构被注射到一个或两个细胞胚胎阶段。在40期尾部组织存在shRNA被确定是通过绿色荧光蛋白的荧光，表明该质粒在细胞中表达，全长beta;-半乳糖苷酶或Nav1.5（GI：184038）RNA转录使用信息机盒（Ambion），每一个目标约5纳克是混合500个绿色荧光mRNA注入胚胎细胞。选择截肢前带有良好的绿色荧光蛋白表达的尾巴实验。

钠通量的调制与染料的成像。在23 hPa下，40期蝌蚪在90uM的电晕绿色指示染料中孵育（Invitrogen）0.1times;MMR 45 min和洗两次0.1times; MMR和30uM N-benzyl-p-toluene磺酰胺（BTS；tocris Bioscience）固定蝌蚪运动。24 hPa的绿色信号，电晕绿色信号在488纳米激发和在516纳米荧光发射数据收集。数据使用IPLab软件分析（BD公司）。为诱导钠电流，0.1 times;MMR补充葡萄糖酸钠（标准差）增加钠浓度为90mM。耐火材料周期分析，尾巴被截肢，在46–47期、18 hPa的动物患者有或无钠90mM和20uM的莫能菌素（Sigma）在0.1times;MMR with 90um电晕绿色45分钟，洗净0.1 times;MMR和50 um BTS两次。跨膜电位成像使用DiBAC4（3）与对照组（Invitrogen）进行到底如前面所述（Adams et al., 2007）。

原位杂交和免疫组化。原位杂交根据标准协议（Harland, 1991）进行探针Nav1.2（ay121368），钠（Armiseacute;n et al., 2002），Notch1（Coffman et al., 1990），MSX1（Feledy et al., 1999），（1319975）和植。非洲爪蟾胚胎被固定在MEMFA缓冲（(Sive et al.,2000），在65°C在50%甲酰胺2小时加热（灭活内源性碱性磷酸酶），透在PBS和0.1%的Triton作用30 min，并进行免疫组化处理使用碱性磷酸酶二次抗体（Levin, 2004)），直到最佳的信号背景最小。表达谱表示从8个分析中得到的一致性模式在每个阶段的12个尾巴。anti-nav1.2（微孔），抗乙酰化微管蛋白（Sigma），和antiphospho—H3（微孔）用于抗体1:1000。量化phospho-h3-positive细胞如以前所说的进行（Adamset al., 2007）。

克隆与基因表达。一个用哺乳动物植TBLASTN搜索序列确定相应的非洲爪蟾cDNA克隆# 6641975（加入# bu915306）在非洲爪蟾的基因库。购买这一克隆的序列被提交给GenBank（登录# 1319975）。十五至二十再生芽（40期；24 hPa）收集和RNA分离Trizol（Invitrogen）。一利用智能基因合成试剂盒生成文库（Clontech）。设计5-tccagtcagtttccgagaaggcagacg引物序列—3（向前）；5-gcaccaggttctgcatctgctgggaatg”—3（反向）被用来确定存在在非洲爪蟾同源cDNA文库。检测基因表达反转录PCR，15–20断尾再生芽收集和RNA分离Trizol（Invitrogen）。核糖核酸转录使用QuantiTect RT Kit（QIAGEN）产生的cDNA实时聚合酶链反应分析。用引物的Nav1.2（向前，5-gcagccactgctacccccac—3；相反，5-gcactgccaccattcccggt—3）和EF1（向前，5-caggccagattggtgctggatatgc-3；相反，5-gctctccacgcacattggctttcct-3）。目标表达归一化，EF1表达。

统计分析。比较了尾部再生实验从得分的数据被使用。对2种治疗方法的比较采用Mann–Whitney U检验–系排名顺序数据，使用正常大样本量的近似。多种治疗方法利用克鲁斯卡尔–沃利斯试验相比，与邓恩Q值校正系等级。所有其他实验使用学生的测试分析。

  1. 结果

再生钠转运的要求

我们确定了一个钠运输的要求，在这过程中一个化学遗传学筛选特异生物调节剂控制再生（Adamset al., 2007）。（三卡因麻醉剂MS222）是一个众所周知的钠电流电压门内控钠通道抑制剂（VGSCs or NaVs)）（Hedrick and Winmill, 2003）（Frazier and Narahashi, 1975）。动物的治疗无论是150或250uM MS222断尾后立即对于7天测定的持续时间显着抑制再生能力，如计算使用的复合日（补充图一，可在www.jneurosci.org作为补充材料）（(RI=114, n=65; and RI=44, n=63, respectively）在与对照的兄弟姐妹相比，剂量依赖性的方式（RI =265，n=68，P＜0.01）（图1A，B）。MS222治疗不诱导细胞凋亡的萌芽和全面发展动物（包括原发尾的增长）是正常的，这说明这是一种再生的特效。重要的是使用的浓度约10倍较常用的诱导蝌蚪麻痹（mM表型，我们描述发生在蝌蚪正常行为和流动,为了演示麻醉剂MS222 NAV抑制钠转运介导的效果，我们可视化的使用科电晕绿钠通量（图1c），荧光选择性与钠离子相互作用的钠指示剂染料在结合后的荧光发射表现出增加（Meier et al., 2006）。在完整的尾巴，很少有细胞出现阳性与大多数尾人口相对的冠绿色信号。24 hPa，强大的电晕绿色信号出现在再生芽区域，但不在其余的尾部和躯干，提示钠转运到细胞中的一个显着增加再生过程中的芽。断尾巴的时候治疗的MS222电晕绿色信号被废除（n=8，P ＜0.005），表明抑制资产净值废除钠涌入芽。因此，我们得出这样的结论：调制在芽中导航依赖性钠通量细胞是重要的再生调节器。

但是，对麻醉剂MS222行动的目标，是调节血浆膜蛋白钠涌入细胞（Yu和Catterall，

2003）。在非洲，Nav1.2通道已经确定，我们检查它们在再生芽中的表达。组织不表达（补充图S2，可在www.jneurosci.org作为补充材料）与在早期的Nav1.2作用过程尾巴再生，Nav1.2 RNA的表达18 hPa在间充质再生芽细胞并持续直到2天（图1d）。Nav1.2蛋白类似的表达（补充图S2，可在www.jneurosci.org作为补充材料）。

要确认的分子基础与再生相关钠信号尾巴再生，我们下烧蚀Nav1.2通过RNAi质粒编码的活动一个简短的核糖核酸发夹结构针对非洲爪蟾Nav1.2基因。靶向载体携带一个绿色荧光标记物（miskevich et al.，2006）在同一质粒，使动物的准确选择表达的RNAi构建远尾。与对照组相比实时定量聚合酶链反应对nav1.2mrnain再生芽24 hPa显示整体下降40%，显示在有效性Nav1.2 RNAi敲除活泼地尽管有一定的镶嵌吸收Nav1.2 RNAi表达载体，表达的短RNA发夹Nav1.2在尾区截肢的地点，能够显着抑制尾再生（RI=198，N=100，P＜0.01）与对照组相比RNAi靶向基因，荧光蛋白这不是内源性的非洲爪蟾（RI=261，N=72），确认我们的药理丢失的功能数据（图。1E）。虽然我们不能排除其他从贡献资产净值的异构体，这些数据表明，非洲爪蟾Nav1.2是专门为尾部再生要求，揭示了一个内生再生反应的重要组成部分并确定电压门控钠的新角色渠道。

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