培养克莱门柚‘Monreal Rosso’和 ‘Nules’的游离小孢子成功形成早期胚外文翻译资料

 2023-01-10 16:16:49

培养克莱门柚lsquo;Monreal Rossorsquo;和 lsquo;Nulesrsquo;的游离小孢子成功形成早期胚

原文作者 Benedetta Chiancone1,Marines M.Gniech Karasawa2, Valeria Gianguzzi2,Ahmed M. Abdelgalel2, Ivett Baacute;raacute;ny3, Pilar S. Testillano3, Daniela Torello Marinoni4,Roberto Botta4 and Maria Antonietta Germanagrave;2*

摘要：小孢子胚胎形成是一种实现植物纯合的方式。它对像柑橘一样具有较长生长期，高度杂合性和自交不亲和性特点的木本植物特别有效。花药培养技术是目前在许多农作物中常用的小孢子胚胎发生方法。而游离小孢子培养避免了体细胞花药组织的影响，因此能更好地在细胞、生理、生化和分子水平上进行探究。这种技术在关键因素的分离过程中具有很大的开发潜力，其中像培养基组成，特别是植物生长调节剂及其浓度的调节可以大大提高胚胎再生效率。据我们所知，mT是一种天然芳香类细胞分裂素，它在诱导柑橘小孢子胚胎产生配子方面的能力仍未被探究过。在本项研究中，两种浓度的mT代替了培养基中的BA或ZEA，对两种基因型柑橘的小孢子培养的影响进行了探究。对两种基因型的柑橘和测试的四种媒介进行十一个月的游离小孢子培养后，在形成多核愈伤组织和小孢子胚的不同阶段观察到了小孢子形态变化和孢子体的发展。对母本和胚样品的微卫星分析表明，由实验媒介诱导产生的所有早期胚的基因，都来源于实验培养采用的小孢子。据我们所知，这是在克莱门柚的两个品种lsquo;Monreal Rossorsquo;和lsquo;Nulesrsquo;中，利用游离的柑橘小孢子培养产生柑橘小孢子早期胚的首次成功试验。

关键词: 柑橘育种、配子发育、纯合子，小孢子培养，mT

引言

生物技术的方法可以用来提高传统育种计划的效率。配子发生是一项从事生物基础性研究和应用性研究的生物技术。对不成熟的配子进行适时的诱导，可以使其偏离正常的配子体发育途径而形成孢子体。孢子体途径可以形成仅含配子染色体数（n代替2n）的单倍体生物体(Hs)，或者由单倍体自发或经过诱导进行染色体复制后，所含遗传信息的所有位点均成为纯合子的双单倍体(DHs)。配子发生技术，特别是小孢子胚胎发生，是获得纯合个体的有效方法。它们可用于重要的育种应用如突变、选择、遗传分析、转化、基因测序(Germanagrave; et al.,2013)等。

发展纯系植株在作物改良计划中非常重要，特别是对于生殖周期较长，高度杂合，植株庞大，自交不亲和的木本植物而言(Germanagrave;, 2006, 2009, 2011a,b; Seguigrave;-Simarro, 2010)更是举足轻重。木本植物常被视为“顽固的物种”。目前已经有一些研究，成功并且高效地完成了木本植物的小孢子胚胎发生过程(Houml;fer, 2004; Ramiacute;rez et al., 2004; Barany et al.,2005; Buenoet al., 2005, 2006; Germanagrave;,2006, 2007, 2009, 2011a;Chiancone et al., 2013; Rodriacute;guez-Sanz et al., 2014; Blasco et al.,2015)。

在拗强的木本水果生产品种中，柑橘位居世界第一，2013年就生产了1亿2600万吨(FAOSTAT Database, 2014)。克莱门柚是经“地中海”普通品种和甜橙杂合而产生的一个柑橘物种。凭借广大消费者的青睐，克莱门柚品种群被认为是西班牙柑橘产业中最具代表性的一种。特别是一种栽培化的克莱门柚lsquo;Nulesrsquo;和一种在地中海作物研究中心由gamma;射线诱变获得 (CRA-ACM, Acireale, CT, Italy）的lsquo;Monreal Rossorsquo;(MAR)。由于其经济效益良好，克莱门柚品系对育种者有很大的吸引力。

迄今为止所有柑橘小孢子胚胎发生的研究报告(Germanagrave; et al., 1994, 2005; Germanagrave;, 1997, 2007; Germanagrave; and Reforgiato Recupero, 1997; Germanagrave; and Chiancone, 2003)中，仅有一个研究对多种柑橘（柠檬、橘子、柑橘、酸橙、柚子）和相关的属的游离小孢子培养做了实验(Poncirus; Germanagrave; et al., 1996)。

自从1974年Nitsch对体外培养烟草游离小孢子做了第一次研究，许多研究已发展到进一步探究，不同种类物质对增加小孢子培养中胚胎发生频率的影响。虽然花药培养施行过程简单且高效，是许多作物形成双单体的常用方法，但游离小孢子培养技术，为我们提供了一个，在细胞、生理、生化、分子水平，研究花粉胚胎发生过程更好的方法(Dunwell, 2010; Prem et al., 2012)。然而，与花药培养相比，游离小孢子培养需要更好的研究设备和更多的专业技能(Nitsch, 1977; Reinert and Bajaj, 1977; Germanagrave;, 2011a)。游离小孢子培养还能避免形成再生体花药组织(Ferrie and Caswell, 2010; Germanagrave;,2011a,b)。

培养过程中许多内源性和外源性因素影响着成熟配子胚的形成(Smykal,2000; Wang et al., 2000)。基因型，供体植株的生理状况和生长条件，配子发育期，花蕾的预处理，培养基和培养条件，以及它们之间的相互作用等各种因素，都会影响到体外培养的细胞(Germanagrave;,2011a,b)。

至今没有单一的标准条件或实验，能达成培养游离小孢子获得植株的目的。一个物种内的不同种类及品种的小孢子胚的发展，可以有很多不同的培养要求。鉴于以上因素，研究提高小孢子胚胎发生效率，重点在于检测生长调节剂对柑橘属和其他果树的花药培养和游离小孢子培养的影响(Germanagrave; et al., 1996, 2006, 2011;Houml;fer et al., 1999; Germanagrave; and Chiancone, 2003; Houml;fer, 2004;Bueno et al., 2005, 2006; Chiancone et al., 2006; Padoan et al.,2011)。

mT是一种天然芳香细胞分裂素，在植物组织培养中被视为一种替代的苄基腺嘌呤（BA）、玉米素（ZEA）或激动素（KIN）(Aremu et al.,2012)，已经在多个物种包括柑橘类植物中被用于提高离体繁殖效率 (Niedz and Evens, 2011)。据我们所知，这种替代性细胞分裂素仍未用于花药和游离小孢子培养，诱导小孢子胚胎发生过程中。Esteves等人最近研究了mT在再生培养基中，对顽固的大麦小孢子培养效果(2014)，在它的诱导下胚胎分化为绿色植物的效果是对照组的2.9倍。

这项研究调查了mT在培养基中作为一种BA或ZEA的替代物，用于克莱门柚的两个品种lsquo;Monreal Rossorsquo;(MAR)和lsquo;Nulesrsquo;中，探究mT对通过小孢子培养方法形成配子胚胎的影响。

材料与方法

植物材料与花粉发育期

四月在意大利巴勒莫大学的果园(Campo drsquo;Orlegrave;ans, Palermo 38 ◦ N)中获取种植的lsquo;Monreal Rossorsquo;和lsquo;Nulesrsquo;的花蕾。用DAPI染色判断每一个花蕾是否处于小孢子发育期。从不同大小花蕾的花药中挤出几滴，加入DAPI染色溶液（1mg/ml）中，并在荧光显微镜下观察(Zeiss,Axiophot, Germany)。为进一步的实验中，只有所含花药小孢子为单核或具有空泡结构（3.5–4.0 mm）的花蕾，才被选用于组织培养。

花蕾灭菌，小孢子分离和培养

花芽在4℃的黑暗条件中放置1周，作预处理。对80个左右的花蕾进行表面消毒，在70%（v/v）的乙醇中浸泡3分钟，随后在25%（v/v）商业漂白剂（含约0.5%的水活性氯）浸泡20分钟，然后用灭菌蒸馏水冲洗三遍。小心地将花药雄蕊从花蕾上分离，存放在无菌的0.4M甘露醇溶液中备用。这些实验步骤由Kumlehn等人探究得出，此处稍加修改。值得注意的是，本次实验中将由花药代替整朵花，用作外植体，密度梯度的步骤直接跳过。游离小孢子以每毫升100000个小孢子的形式培养，每毫升培养液放入一个3001型的皮氏培养皿(35 mmtimes;10 mm,BD Biosciences)中。

所有培养皿在前30天均置于26plusmn;1◦C在黑暗条件下培养，然后放在冷白色荧光灯 (Philips TLM 30W/84,France)下，在光合光子通量密度为35 mu;mol mminus;1 sminus;1条件下光照16个小时。

媒介组合

培养过程中，特定的媒介（简称媒介P）在通过小孢子培养法获得柑橘小孢子胚胎发生的实验中曾被使用过 (Germanagrave; et al.,1996;Table 1)。这种媒介，在其他植物生长调节剂中，存在多种细胞分裂素，特别是BA、ZEA、KIN。为了研究mT的影响作用，mT用于替代相等浓度的BA或ZEA（分别为媒介：PmT/BA, PmT/ZEA）或将浓度提高10倍使用（分别为媒介：PmT/BA10, PmT/ZEA10）。

实验中特别对以下媒介进行了测试：

(1) PC（控制媒介）：0.5mg/L BA 和0.5mg/L ZEA；(Germanagrave; et al.,1996);

(2) PmT/BA: 无BA 其他与PC一致 0.5 mg/L mT;

(3) PmT/ZEA: 无ZEA 其他与PC一致 0.5 mg/L mT;

(4) PmT/BA10: 无BA 其他与PC一致 5.4 mg/L mT;

(5) PmT/ZEA10: 无ZEA 其他与PC一致 5.6 mg/L mT.

每种媒介做七个重复组，每品种材料需使用35个培养皿。

获得的早期胚胎转接到不同的固体培养基（表2），试图诱导胚胎发芽。

小孢子体外应答评价、数据处理与统计分析

培养皿中含有游离小孢子的培养物，需每周通过倒置显微镜(Zeiss)和双目显微镜(Leica)观察。组培过程中，每月需取游离小孢子的样品，通过DAPI染色，荧光显微镜下观察 (Zeiss, Axiophot, Germany) 来监控他们的体外发育情况。经过7个月的培养，每种处理媒介，分别对400个小孢子进行DAPI染色（约每100个小孢子一组，重复四次），通过荧光显微镜观察(Zeiss, Axiophot, Germany)。对不同的结构特征进行了观察与记录：小孢子单核，刚开始进入孢子体途径时形成大小不同的双核，三核，四核及多核。此外，在体外培养11个月后，使用双目显微镜，对每个培养皿产生的愈伤组织和胚数量进行观察和记录。这些数据最后用于诱导媒介的效果评估。采用SYSTAT 13软件进行统计分析。取用两个因素：“品种”和“培养基”，对它们之间的差异进行双向方差分析（ANOVA），结果ple;0.05。然后用Tukey检验分离方法是否合理。

显微分析的固定与处理

体外组培时，将小孢子和小孢子衍生结构固定在4%多聚甲醛在磷酸盐缓冲液（PBS）中，在4℃条件下培养过夜。固定后，小孢子培养的样品被嵌入在明胶中、被冲洗入PBS中，在4℃条件下通过丙酮反应链脱水，使目标物渗透并嵌入8100丙烯酸树脂 重(Kulzer, Germany)，这种方法先前由Solis等人探究并发表过（2008）。用0.075%甲苯胺蓝水染色液，处理半薄切片（1mu;m）10–15分钟。将切片冲洗和干燥后，置于在Eukitt中封片，在明亮条件下，用搭载了徕卡公司DFC420C数码相机的光学显微镜Zeiss 68105观察，并进行结构分析。

通过SSR进行等位基因型检测

等位基因型是用克莱门柚的 lsquo;Monreal Rossorsquo; 和 lsquo;Nulesrsquo;品种中获得的胚胎和培养的游离小孢子进行检查所得。从母本的植物叶和体外培养的胚胎中分别提取DNA，用胰岛素针收集起来。DNA样品在液氮中冷冻保存，用钢珠和组织研磨仪(QIAGENR , Germany)研磨。利用Doyle和Doyle（1987）的方法进行了DNA提取。母本的DNA悬浮于60mu;L的TE缓冲液(Tris-EDTA, pH 8.00)中，然后稀释至10 ng/mu;L。胚胎的DNA是悬浮在25mu;L的TE缓冲液中。

Novelli等人从C. sinensis中分离了十个微卫星位点（2006）Froelicher等人对C. reticulata叶片中提取的DNA作了初步筛选(2008)，其中一个位点在亲本基因型中表现杂合性：CCSM147(Novelli et al., 2006)。此位点被用于评估胚胎的等位基因基准。

聚合酶链式反应(PCRs)分两个步骤进行，在总量为10 mu;l中包含了3 mu;L DNA（相当于30 ng的母本植物DNA量），0.25 U的KA

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