新鲜水果和蔬菜表面的细菌群落外文翻译资料

 2023-01-10 16:17:42

新鲜水果和蔬菜表面的细菌群落

原文作者 Jonathan W. Leff 1 , Noah Fierer 1,2 *

1.环境科学，州立科罗拉多大学，博尔德，科罗拉多州，美国

2.生态学和进化生物学系，州立科罗拉多大学，博尔德，科罗拉多州，美国

摘要：

新鲜水果和蔬菜可以携带大量多种类型的细菌种群。然而，对于大部分的农产品相关细菌的工作都集中在一个相对少量的致病细菌。因此，我们对于这些农产品上细菌群落的整体多样性和组成以及这些群落的构成与农产品类型之间的变化了解的不多。此外，我们对于不同耕作方式对消费者已熟知的细菌群落的潜在影响缺乏一个全面的看法。我们通过对常规的和11种商店买的有机类似物产品类型使用独立培养，16 S rRNA基因测序的方法来评估细菌群落结构，从而解决这些知识差距。我们的研究结果表明水果和蔬菜有不同的细菌群落，并且细菌群落随着农产品的类型不同而有显著区别。然而，相比于一些农产品类型（如苹果、桃子、葡萄、蘑菇）上的细菌进行分类主要属于放线菌，拟杆菌，厚壁菌门，变形菌门。某些农产品类型（如豆芽、菠菜、生菜、西红柿、辣椒、草莓）则倾向于拥有更多相似的群落，它们都属于肠杆菌科，具有较高的相对丰度。虽然这受耕作实践以外的其他因素的潜在驱动，我们观察到在常规的和有机物类似物的农产品类型上的细菌群落的组成有显著的差别。这些差异往往归因于肠杆菌科细菌类群的相对丰度差异，而肠杆菌科细菌类群在有机种植的农产品中一般不太丰富。两者结合，我们的研究结果表明人类暴露于多种不同的细菌中。根据不同类型的新鲜农产品，细菌消耗的常规和有机养殖品种之间的差异有助于这种变化。

引言：

新鲜果蔬，包括苹果，葡萄，莴苣，桃，辣椒，菠菜，甘蓝和西红柿，已被熟知能携带大型细菌种群[1–7]，但是我们才刚刚开始探索这些果蔬携带的群落的多样性。我们知道重要的人类病原体与农产品有关（如单核细胞增生李斯特氏菌、大肠杆菌、沙门氏菌）。而如果新鲜农产品生的被食用[8–11]，这些病原体会引起广泛的疾病爆发。除了直接导致疾病外，这些在农产品上的微生物可能会有其他的、不太直接的、对人体健康的影响。与植物相关的非病原微生物可能会影响过敏的发展[12]。新鲜的生的农产品的消耗可能代表着共生细菌的新种群引入人体胃肠系统的一种重要手段。更普遍的是，农产品相关的微生物对食品腐败率有重要影响[13]，一些厨房表面上发现的微生物来源于农产品[14]。

以前研究新鲜农产品上的微生物群落的工作一般集中在培养的病原细菌和真菌(广义的 [9])，只有少许近来的研究利用独立培养的技术评估了农产品相关的微生物群落的组成。从以前的工作中，一些关键的模式出现：(1)不同类型的农产品和栽培品种携带有不同丰度的特定细菌群[9]，(2)农业和储存条件可能影响农产品上的微生物群落的组成和丰度[3,5,15–18]，(3)非病原微生物可以与农产品表面的微生物病原体相互作用和抑制[7,9,19–21]。虽有这一机构的工作，我们对于农产品相关的微生物群落的多样性，影响这些群落组成的因素，跨农产品类型的个体类群的分布(尤其是那些难以培养的类群)的理解仍然是有限的。

我们期望微生物群落的整体构成因各种原因而随着农产品种类的变化而变化。首先，我们从以前对树的叶表面进行的研究中发现不同的植物谱系有可能有非常不同的细菌群落[22,23]。此外，我们知道可以改变微生物群落组成，包括酸碱度和可获得的水分的一系列的环境因素可以改变不同的农产品类型[6,13,24]。同样的，生长条件，运输程序和储存条件的差异可以影响与农产品相关的微生物群落的组成和多样性。如：我们预计更接近地面的农产品上土壤微生物类群的相对丰度较高，并在寒冷的温度下储存更长的时间的农产品上可能会有更大的耐冷菌的丰度[6,15,16,25]。

耕作措施也可能对与农产品相关的微生物群落的组成有重要的，研究中的影响。发达国家的消费者通常通过对有机和常规养殖产品项目的选择来接触不同的耕作方式。有机耕作在很多方式上都不同于常规的耕作方式，包括所使用的肥料和农药的种类。这些差异对农产品表面的微生物群落的结构有潜在的影响[4,17,18,26]。但是，我们不知道耕作方式对农产品表面的微生物群落的潜在影响是不是在广泛的产品类型中都是明显的，以及这种影响是否能持续到农产品被购买和消费的时候。

本研究的目的是描述出在销售点的多种水果和蔬菜表面的细菌群落的特征。我们专注于那些经常生的被食用的农产品。因为与熟食相比，当我们食用生的食物时，我们有可能接触到更多的活细菌。具体来说，我们解决了两个基本问题：(1)细菌群落结构是如何随着农产品类型的变化而变化的？(2)耕作实践的差异，如那些用于常规和有机农场的对已被终端消费者消费的农产品表面的细菌群落的组成是否有潜在的影响？因为我们知道文化为基础的技术并没有充分捕捉到农产品上的很大一部分的细菌多样性[27]。我们利用高通量测序分析从农产品表面的细菌中提取的DNA上的16SrRNA基因解决了这些问题。

材料与方法

样品收集

新鲜农产品从贮存于Boulder, CO, USA的三个不同品牌的食品杂货店中购买。这些产品包括11种产品品种，其中9种有有机和常规标记的两种类型。对农产品的类型和数量重复的描述在表1。在美国，有机耕种的农产品与常规耕种的农产品是不同的。合成的农药和化肥，电离辐射，污水一般不允许在产品中使用。(http://www.usda.gov/)

我们承认在常规的和有机标签的农产品之间的差异是可以归因于一些因素，这些因素不一定反映的是以标签为代表的耕作方式的差异。这些包括在农场的位置，运输，储藏条件和时间的潜在差异。但是，这些因素很难去控制，因此，我们研究的目的是在耕作方式影响能被终端消费者获得的农产品上的细菌群落上评估潜在的大规模的差异。

生菜和菠菜样品是预先冲洗和包装销售的，其他产品项目的收集要么是在商店进行包装(葡萄，生菜，蘑菇，菠菜，豆芽，草莓)要么是用无菌塑料袋(苹果，桃子，辣椒，番茄)。重复样品从每个商店出售前包装的分散的包装袋(相同的品牌)中进行收集。其他农产品类型的重复样品从分散的水果中收集。细菌样品是在同一天从商店内的每种产品的样品上收集的。每三个商店都在一周内完成采样。细菌标本是从农产品样品中收集的，这些农产品样品要么用无菌棉擦拭(以下的程序在[14]中描述)要么用无菌水漂洗以减少叶绿体的集合(表1)。在漂洗过程中，水和产品样品被添加到无菌塑料袋中，轻轻的摇了5分钟。在漂洗水中，细菌通过真空过滤被收集到0.2毫米的过滤器(Corning, Inc., Tewksbury, MA, USA)中。棉签和过滤器应在进行分子分析前的两周内储存在-20摄氏度中。DNA从使用先前描述的修改[ 28 ]的总HTP试剂盒(MO生物实验室，Inc.，卡尔斯巴德，CA，USA)棉签和过滤器中提取。

细菌群落组成和多样性的测定

16 S rRNA基因序列通过454焦磷酸测序去量化已收集的215个产品样品相关的细菌群落的多样性和组成成分。他们使用在[23]中描述的过程：从所提取的基因组DNA中扩增和测序。简而言之，序列进行PCR扩增的引物一式三份（799 F / 1115 R）并不扩增叶绿体DNA [ 23,29 ] 。反向引物中含有12个碱基的每个样本独特的条形码序列。三反应结合，DNA浓度测定，每个样品的相同数量的DNA也结合在一起。这种混合DNA样品清理时需使用超净PCR纯化试剂盒（MO生物实验室，Inc.，卡尔斯巴德，CA，USA），测序时在罗氏454测序平台南卡罗来纳州大学的engencore设施上。

16 S rRNA基因序列进行qiime V 1.4.0管道[30]操作去决定与农产品相关的细菌群落的多样性和组成。使用默认的参数，除了只有240和400个碱基之间的唯一序列的两个引物被保留用于下游分析。分类标识被分配到操作分类单元（OTUs）使用RDP分类[31]训练的greengenes微生物16 S rRNA基因序列数据（2011年2月4日修订；greengenes.LBL.gov），聚集在97%的相似性阈值。 因为我们获得了每种样品的可变数量的序列（从只有几个序列到超过4000），序列数据稀薄成每种样品200序列去解释这种变化。稀疏导致一些样品被进一步分析之前就消失，样品数量的信息列入了在表1的下游分析中。在每个样品的200个序列中，我们不能够调查在每个样品的细菌多样性的充分程度，但以前的工作表明，这种深度的采样对于准确的评估alpha;和在两叶表面[23]和其他微生物栖息地[32]的beta;多样性模式是足够的。扩增序列存放在公共EMBL-EBI数据(http://www.ebi.ac.uk/)中，并且可以使用登录号访问，ERP002018。

统计分析

为了在产品项目（beta;多样性）上评估微生物群落组成的差异，我们计算了系统发育指标（加权和不加权的UniFrac 距离[33,34]）和分类度量（布雷柯蒂斯相异的对数变换的OTU丰度计算）。在产品类型间整体间的细菌群落组成和耕作实践类型（新鲜农产品上的有机与常规细菌群落PLOS ONE |www.plosone.org 2 2013年3月|8卷|3期|e59310 tional)）之间的差异以产品类型和耕作实践为固定因素，杂货店品牌作为随机因素，使用置换多元方差分析测试（PERMANOVA）。PERMANOVA测试也用于农业实践对细菌群落内的个体产品类型的影响试验。分类丰富度的显著差异是通过采用非参数Kruskal沃利斯检验产品类型和在常规和有机产品之间采用t检验进行评估的。个体细菌类群相对丰度的显著差异是通过采用方差分析和错误发现率（FDR）校正的产品类型或因子水平决定的。T检验被用于比较常规和有机物之间的个体类群的相对丰度。所有的多变量分析都使用引物6 [35]，单因素分析都使用R [36]。

表1：产品品种和样品数

结论

跨产品类型的细菌群落多样性和组成差异

变量，分类丰富度水平不同的十一个产品类型（磷，0.001）中丰度最高的桃子，苜蓿芽，苹果，辣椒，蘑菇；最低的豆芽和草莓（图1）。作为每种产品类型的代表，在17和161科之间的产品类型，其细菌群落是高度多样的。但是，这些科中的大多数是罕见的。平均而言，只有3到13科代表了至少每种产品类型的两个序列。在某些情况下，OTUs被分配到单一细菌科为主。例如，豆芽、菠菜和草莓中的88，58，和 53%的OTUs分别的被分配到了肠杆菌科细菌。相比之下，苹果这一类群比较均匀，没有单一科占8%以上的序列（图2）。

在整个农产品类型中，相对于他们的分类结构，细菌群落也不同。相比于耕作实践或商店品牌，产品类型对细菌群落组成的观察到的变化有更大的影响（表2）。此外，成对测试显示各产品类型表面的群落组成与另一个差异显著（P = 0.001在所有的情况下；图S1）。而且，相比于其它，某些特定的产品类型共享更多相似的群落结构。平均而言，相比那些其他产品类型，树的果实倾向于共有更相似的成分组成的群落。通常生长接近土壤表面的农产品（菠菜、生菜、西红柿、辣椒）共享在组成上比较相似的群落。葡萄和蘑菇的表面细菌群落与其它研究的农产品类型非常的不相似（图2）。

在所有的样品中，最丰富的细菌科为肠杆菌科细菌[ 30% ]（平均）、芽孢杆菌（4.6%），和固氮菌科（4%）。但是， 一些细菌科在个体产品类型上有较高的相对丰度（图2）。几乎所有丰富的细菌科（在任何农产品类型中占3%的序列）在农产品类型中的相对丰度都不同。在这些科中，只有19个细菌科中的2个的相对丰度在整个农产品类型中没有显著差异（图2）。肠杆菌科细菌，例如，在豆芽，菠菜，生菜，西红柿，辣椒，豆芽菜和草莓（至少20%）中是最丰富的科，但在苹果，桃子，葡萄和蘑菇中就大幅降低了相对丰度（图3）。如前所述，肠杆菌科细菌是主要负责上述聚类模式。在图2中，除了较低的相对丰度的肠杆菌科细菌群落，那些具有较高相对丰度的肠杆菌科细菌的群落倾向于集群。相比于其它农产品类型，苹果和桃子倾向于拥有更大相对丰度的细杆菌和鞘脂单胞菌科。葡萄表面群落显示了从芽孢杆菌科和醋酸杆菌科中有较大的贡献。与其它农产品类型存在最大不同的蘑菇有较大的相对丰度的微球菌科，鞘杆菌科，假单胞细菌科的（图2）。在科水平上的群落组成的差异模式也反映了在所有农产品类型中的优势属的差异。泛菌属在大多数农产品类型中有较高的相对丰度，肠杆菌科细菌（有20%已经报道过）也有较高的相对丰度。但是，其它农产品类型的优势属是根据特定的农产品类型而定的（表3）。

图1：每个产品类型的分类丰度的盒形图，常规（C）和有机（O）等量，样品被稀薄成200序列，界限代表异常值。

doi:10.1371/journal.pone.0059310.g001

潜在的耕作实践影响细菌群落

常规和有机标记类似物表面的分类丰度差异取决于产品类型（表1）。有机标记的产品比常规标记的产品对菠菜，生菜，西红柿有更明显的OTU丰度，并显著降低了桃子和葡萄的OTU丰度（P＜0.05为例，图1）。

考虑到农产品类型和存储品牌（P=0.001）的变化，细菌群落的组成在常规和有机标记的产品样品之间也有显著的差异。耕作实践比存储品牌（表2）与群落组成有更紧密的联系。而且，群落结构在常规和有机标记的每种产品类型的样品之间有显著的差异（所有情况下P＜0.05，表4）。在农产品类型中（表4），虽然分类造成的在常规和有机标记的产品之间已观察到的区别是不连续的，不同产品类型中常规的标记的品种有更大的相对丰度的肠

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