从抗癌植物中分离能够产生L-天冬酰胺酶的内生真菌外文翻译资料

 2023-01-10 16:17:51

从抗癌植物中分离能够产生L-天冬酰胺酶的内生真菌

原文作者 YiingYng Chow, Adeline S.Y. Ting

摘要：内生真菌是天然的生物活性化合物的新来源。此次研究是为了找寻产生L-天冬酰胺抗癌酶的内生真菌，并且利用这种菌实现大规模生产。四种具抗癌特性的植物被选为寄主植物，分别是柠檬草，九里香，白花蛇舌草和七星针。由于天冬酰胺在L-天冬酰胺酶的作用下水解成天冬氨酸和氨，使酚红染料指示剂从黄色（酸性条件）转变到粉红色（碱性条件）。所以可以通过检测琼脂上是否有粉红色区域的形成，来判断是否存在L-天冬酰胺酶，并且通过Nesslerization技术进一步测量L-天冬酰胺抗癌酶的含量。实验结果显示，共有89种不同形态的内生真菌被分离得到。大部分来自七星针（40），其次是白花蛇舌草（25），柠檬草（14）和九里香（10）。在89种形态中只有25种能产生L-天冬酰胺酶，而这25种形态大多来自七星针。产生的酶的活性在 0.0069 ~ 0.025 mu;MmL-1min-1。一般认为可能从炭疽病菌属，镰刀菌，茎点霉和青霉菌中分离得到L-天冬酰胺酶。此次研究表明，内生真菌是一种很好的用于生产L-天冬酰胺酶的替代来源，它们可以从抗癌植物，特别是七星针中提取得到。

关键词：抗癌植物、炭疽病菌、内生真菌、镰刀菌、L-天冬酰胺酶

简介

内生菌是寄居在在健康植物各种组织和器官内部，而不会对宿主植物引起明显病害症状的微生物[1]。内生真菌在植物中普遍存在，并且由于内生真菌能够重视合成多种有用具有生物活性的化合物而受到广泛重视[2]。这些具有生物活性的化合物最初是与抵抗植物病原体的防御机制有关[2]。然而，在最近几年，由于内生真菌产生的这些化合物具有广泛并且多样的生物活性，而被逐渐用于新药的发现，例如作为抗生素，抗癌药剂，抗氧化剂和抗炎剂[3]。由于发现了内生真菌Taxomyces andreanae产生的化合物紫杉醇（Taxol），对植物内生真菌产生的具有生物活性化合的研究得到了进一步的提升[4]。这种抗癌剂以前是从太平洋红豆杉树中提取的，而通过这一发现，就不必砍伐大量的红豆杉树，也能够生产出紫杉醇。由于红豆杉树中的内生真菌T. andrenae的发现，许多研究人员推测，抗癌植物中的内生真菌能够合成具有抗癌特性的化合物。这促使对植物内生真菌产生抗癌化合物的研究，例如喜树碱[5]，美登素[6]和cajanol [7]。在此次研究中，针对的是产生L-天冬酰胺酶的内生真菌。

L-天冬酰胺酶(E.C.3.5.1.1)是催化L-天冬酰胺的水解成L-天冬氨酸和氨的酶[8]。在癌症治疗中，癌细胞的生长需要大量的天冬酰胺，而L-天冬酰胺酶可以清除血清中的天冬酰胺，从而有效控制了肿瘤生长[10]。实际上，在急性淋巴细胞白血病（ALL）的临床治疗中，L-天冬酰胺酶是一种普遍利用的抗癌剂[9]。L-天冬酰胺酶通常从大肠杆菌和软腐病菌这类细菌中分离得到，因为这类菌成本较低，这样能够使效益最大化[8]。但是，从原核生物中分离得到的L-天冬酰胺酶现已被发现有很多副作用，主要的副作用是导致了过敏性反应的过敏症。因此，在最近几年，将真核菌类作为L-天冬酰胺酶的来源受到广泛关注，但是这类研究是近期才开始，所以只有少量研究是关于这一方面的[2]。

在此次研究中，内生真菌是从四种常见的马来西亚药用植物中分离提取。这四种植物分别是叶仙人掌属（七星针），九里香（咖喱植株），白花蛇舌草（中药白花蛇舌草）和柠檬草（香茅）。这些植物有较高的药用价值。七星针可以用于治疗糖尿病，高血压和癌症[11] .咖喱植物九里香常被用痔疮，头痛，胃痛，流感，毒蛇咬伤，痢疾，腹泻和癌症的传统治疗药物[12]。尽管是否能从这些被选择的植物中生产得到L-天冬酰胺酶还不能确定，但我们知道，由于植物是具有抗癌特性并且需要的菌类是植物的内生真菌，所以是有可能将产生L-天冬酰胺酶的内生真菌分离出来。有许多其他的研究是关于从许多不同的药用植物中分离得到能产生生物活性物质的内生真菌。除此之外，L-天冬酰胺酶是一种通常来源于微生物的重要抗癌物质。我们都希望在实验研究中得到能够产生L-天冬酰胺酶的内生真菌就像发现产生紫杉醇的T. Andrenae内生真菌[4]。

迄今为止，虽然从九里香分离得到内生真菌Campylospora chaetocladia的研究已经被报道，但是关于七星针和九里香的内生真菌的研究还是有限的[13]。同样的，尽管在中国白花蛇舌草已经被使用多年用于治疗肝炎，咽喉炎和肝、肺、胃的恶性肿瘤，但是还没有尝试分离白花蛇舌草的内生真菌[14]。相反，在被选的植物中，白花蛇舌草具有更多样的内生真菌。这种植物被用于治疗发烧，感染，头痛以及具有抗肿瘤和抗发炎的特性，可能具有多种内生菌，例如曲霉属、枝孢属、粘帚孢霉、大茎属、青霉和木霉菌[15]。然而，还没有从该植物中分离得到L-天冬酰胺酶产生的报道。

此次研究的目的是为了探究将产生L-天冬酰胺酶的内生真菌从四种马来西亚的药用植物（七星针，九里香，白花蛇舌草和柠檬草）分离得到并且进行利用的可行性。内生真菌的多样性以及内生真菌产生L-天冬酰胺酶将在这篇文章中被报道。

材料和方法

分离和培养

内生真菌是从新鲜的抗癌植物的叶和茎中分离得到的。 抗癌植物包括柠檬草、九里香、白花蛇舌草和七星针。这些植物是从马来西亚雪兰莪州Bandar Tun Hussein Onn的一个封闭式花园中随机抽样的。先将植物组织用自来水冲洗15 min，然后将叶组织切成2cmtimes;2cm的片段，而茎组织切成2 cm长度的段。将植物组织用三重消毒技术进行消毒：用40％家用漂白剂漂白5 min，然后分别在50％，70％，90％和100％乙醇浸泡2 min，最后用无菌蒸馏水快速冲洗。同一批植物组织需重复进行上述过程两次[16]。将表面消毒的植物组织片段割伤然后接种在添加了孟加拉红（0.033 gL-1）和氯霉素（0.05 gL-1）的马铃薯葡萄糖琼脂（PDA，Merck），以此来分离内生真菌[8]。对照组的处理是将表面灭菌但未割伤组织片段接种到PDA平板上。由于植物组织经过了有效的表面灭菌所以对照组没有菌丝的生长，而受伤的组织中生长的菌丝就是植物的内生真菌。将所有的PDA平板在28plusmn;2 ℃下培养7-14天。随后将真菌菌落转移到新的PDA平板进行培养。

对产生L-天冬酰胺酶的内生真菌的筛选

将5 mm的真菌菌丝体塞接种到改良的察氏霉素（McDox）琼脂上 [琼脂粉（20.0 gL-1），葡萄糖（2.0 gL-1），L-天冬酰胺（10.0 gL-1），KH2PO4（1.52 gL-1），KCl（0.52 gL-1），MgSO4·7H2O（0.52 gL-1），CuNO3·3H2O（0.001 gL-1），ZnSO4·7H2O（0.001 gL-1），FeSO4·7H2O（0.001 gL-1）]另外再添加L-天冬酰胺（10.0 gL-1）和0.3mL的2.5％酚红染料（指示剂）[17]。对照组的菌丝接种在不添加天冬酰胺的McDox琼脂上。每一种分离得到菌丝重复三个样。将所有的平板放置在28plusmn;2 ℃培养。培养5天后，测定粉红色显色区域的直径[8]。

内生真菌产生的L-天冬酰胺酶的活性

分离内生真菌的代谢物，将其置于McDox液中并以120 rpm的转速培养5天。培养后，移取100 mu;LMcDox液（粗酶）2 mL离心管中。再加入100 mu;L的Tris HCl（pH7.2），200 mu;L的0.04 M天冬酰胺和100 mu;L无菌蒸馏水（SDW）。将混合物在37plusmn;2 ℃培养1 h。培养结束后，加入100 mu;L1.5 M的三氯乙酸（TCA）来停止酶反应。然后吸取100 mu;L混合物加入到含有750 mu;LSDW和300 mu;L纳氏试剂的新的离心管中[18]。将新的离心管在28plusmn;2 ℃培养20 min之后，在450 nm下测量样品的吸光度。在37plusmn;2℃下，每分钟催化形成1 mu;mol氨所需的酶的数量表示一单位天冬酰胺酶的活性[18]。

鉴定产生的L-天冬酰胺酶内生真菌

挑取内生真菌置于马铃薯葡萄糖液中，并且在28plusmn;2 ℃下培养五天。从湿重为200 mg的新鲜菌丝中提取基因组DNA[19]。首先将菌丝体在液氮中研磨，然后使用GF-1植物DNA提取试剂盒-50用制剂氨，按照制造商（Vivantisreg;Technologies，加利福尼亚州，美国）所描

述的方法提取基因组DNA（gDNA）。之后，使用通用引物ITS1（5rsquo;-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3rsquo;）和ITS4（5rsquo;-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3rsquo;）扩增基因组DNA[32]。PCR反应在5 mu;L的反应混合物中进行，其中包括5mu;L的基因组DNA（〜100 ng），5 mu;L浓度为10 mu;M正向引物（ITS1）和反向引物（ITS4），25 mu;L GoTaq @Green Master Mix 2x（Promega，马来西亚），和10 mu;L的无核酸酶水（Promega，马来西亚）。扩增过程包括在95 ℃下预加热1 min，接着进行34个循环包括在95 ℃变性30 s，在60 ℃退火40 s，在72 ℃延伸90 s，最后再在72 ℃下延伸5min。扩增反应在MyCycler基因扩增仪（Bio-Rad）中进行。 用加染液的1％（重量/体积）琼脂糖凝胶（Biotiumreg;）电泳检测PCR反应的产物，并通过紫外透射来观察结果。然后，使用 the Wizardreg;SV Gel和PCR净化系统（Promegareg;）纯化PCR反应的产物，并且利用1st Basereg;Techniques进行测序。将测序的结果与国立生物技术信息中心中的数据进行比较。国立生物技术信息中心中的数据可通过美国（NCBI）的BLAST搜索（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST.cgi）得到。

统计分析

本次实验是完全随机设计（CRD）的，每个参数都重复三次进行评估。并利用社会科学统计软件包（SPSS）版本20.0对数据进行统计分析，运用单因素方差分析和杜凯氏差距检定对收集到的所有数据进行分析。若P lt;0.05，则认为差异显著。

结果

内生真菌的分离

从四种抗癌植物的699段组织中分离得到355株内生真菌菌株。分离得到的内生真菌大多来自七星针（203株），其次是白花蛇舌草（68株），柠檬草（49株）和九里香（35株）（图1）。还可以发现，在四种植物中从叶组织中分离得到的内生真菌比茎组织中的多（图1）。这一点在七星针植物中很明显。在七星针叶组织中发现190株内生真菌，而茎组织中只发现了13株（图1）。由于内生真菌数量很多，所以将菌株进一步分成89种形态。每种形态类型包括具有相似的形态和特征的菌株。 七星针具有最多形态的内生真菌（40种形态），其次是白花蛇舌草（25种形态），柠檬草（14种形态）和九里香（10种形态）。在后续实验中，将继续使用形态来区分内生真菌。

检测产生L-天冬酰胺酶的内生真菌及其活性

在89种内生真菌（形态）中，只有25种是能产生L-天冬酰胺酶内生真菌（图2）。因为这些内生真菌产生的L-天冬酰胺酶，使天冬酰胺水解变成天冬氨酸和氨，使得酚红染料指示剂从黄色（酸性条件）转变成粉红色（碱性条件）（图3），所以这些菌株形成了明显的粉红色的区域。各种形态的内生真菌形成了不同直径的粉红色区域，范围从0.4至3.7 cm，平均为1.2 cm。

内生真菌产生的天冬酰胺酶的活性范围是0.0069至0.025 mu;M-1mL-1min-1（表1）。其中18种形态的内生真菌产生的天冬酰胺酶具有相对较高活性被认为具有相对较高的天冬酰胺酶的活性（0.010-0.025 mu;M-1mL-1min-1），而其中7种内生真菌（PBL1，PBL2，PBL4，PBL6，PBS2，PBL9，CCL2）产生的天冬酰胺酶活性较低（0.0069-0.0098 mu;M-1mL-1min-1）（表1）。从植物中分离得到的PBS1，PBL13，CCL1，ODL4

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