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超声波辅助提取响应面法优化葛根异黄酮

Ka H.Wong, George Q.Li, Kong M.Li , Valentina Razmovski-Naumovski ,

Kelvin Chan

摘要：葛根（PLR），由于其高异黄酮内含物具有对氧化应激发挥细胞的保护作用。在本研究中，通过响应面法（RSM）优化了具有高细胞保护作用的异黄酮的最大回收的超声辅助提取条件。二阶多项式拟合实验数据（R2：0.9736; p值lt;0.0001）。最佳提取参数确定为：提取时间16.02分钟，乙醇浓度41.41％，液-固比为44.35 mL / g。实际实验提取时间16.00 min，乙醇浓度41.00％，液 - 固比44.00mL / g进行。随后对EA过氧化氢诱导的氧化应激存活率为82.90plusmn;0.78％，hy926，与85.60％的预测相当。鉴定提取物中有五种化学成分发挥细胞保护作用。总而言之，这种方法成功地整合了RSM和偏最小二乘回归方法优化PLR提取物具有最高细胞保护活性的PLR提取物。

关键词：葛根葛根茯苓响应面法超声辅助提取

1.简介：

葛根（Puerariae Lobatae Radix; PLR）干根，作为东南亚的一种多年生藤本植物已经被用作功能性的食物，用于治疗发烧，痢疾，腹泻，糖尿病，高血压，心肌梗死心律失常。俗称葛根或葛根。PLR是异黄酮的丰富来源，广泛认为异黄酮的有益作用主要是由于它们抗氧化性（Jin，Son，Min，Jung，＆Choi，2012）。然而，介导植物影响的生物活性成分仍然没有结果。

葛根素作为葛根最丰富的成分（Wong，Razmovski-Naumovski，李，李，陈，2015a），由中华人民共和国药典推荐用于认证PLR的化学标记，被认为是对其大部分药理活性负责，包括细胞保护和抗氧化活性（人民共和国药典，中国，2015年）。然而，在我们以前的研究中，我们已经知道PLR提取物的抗糖尿病作用不仅取决于葛根素，还有存在于提取物中的少量异黄酮（Wong et al。，2015a），包括30-羟基脯氨酸，30 - 甲氧基葛根素，奇异子，黄豆苷，大豆黄素，染料木苷和染料木素（Wong，Razmovski-Naumovski，Li，Li，＆Chan，2013）。

提取物的使用遵循中医的基本整体理论，治疗效果基于许多组分的添加剂和/或协同作用。然而，植物材料的提取允许可变，并且预定条件将允许优化提取物中的生物活性成分的一致性。

响应面法（RSM）是用于分析经验模型的统计实验方案，其描述了几种独立变量（例如溶剂浓度和提取时间及其相互作用）对一个或多个依赖（响应）变量（包括细胞保护活性）的影响。RSM成功应用于优化植物中多酚，多糖和蛋白质的提取，提取物与最高的生物活性相关（Amado，Franco，Sanchez，Zapata，＆Vazquez，2014; Yang et al。，2015）。与传统和其他现代提取技术相比，超声辅助提取（UAE）降低了萃取时间，提取温度，能量输入和有机溶剂的消耗，提高了化学动力学，溶解度和实验重现性（Vilkhu，Mawson，Simons，＆Bates，2008）。

本研究的目的是为了通过使用RSM统计方法优化具有最大生物活性的PLR的异黄酮的快速UAE状态，并比较实验和预测的细胞活力值。提取参数（自变量）包括提取时间，乙醇浓度和固-液比。通过测量人类内皮细胞对过氧化氢的细胞保护作用来评估药理学活性（反应变量）（H2O2）诱导的细胞死亡使用细胞活力测定。选择细胞保护性测定法与PLR的优化提取条件和PLR的生物活性相关联，原因是其简单性和与中药在临床上的应用。此外，细胞保护活性与抗氧化活性相关。随后，通过液相色谱-质谱鉴定生物活性成分。据了解，这是第一项基于体外细胞保护活性优化葛根提取过程，并确认提取物中的活性化合物的研究。

2.材料与方法

2.1试剂与药品

试验中使用的试剂均为分析纯。过氧化氢和3-（4,5-二甲基噻唑基-2）-2,5-二苯基四唑溴化物（MTT）购自SigmaAldrich（MO，USA）。从Tauto Biotech（中国上海）购买了包括葛根素（gt; 98％），黄豆苷（gt; 99％），黄豆苷原（gt; 99％），染料木苷（gt; 98％）和染料木素（gt; 99％））的参考化合物。去离子水通过Millip-Q水净化系统（Millipore（MA，USA））纯化。所有其他化学品和溶剂均得自Thermo Fisher Scientific（NSW，Australia），除非另有说明。

2.2草本药品

从中国和澳大利亚各地区草药药房购买了17份干燥的PLR样品（表S1），植物材料由澳大利亚悉尼大学药学院的George Li博士认证。通过比较PPRC中描述的宏观，微观和化学特性，对17个贸易样本进行了认证（中华人民共和国药典，2015年）和以前研究（Wong et al。，2015a）。凭证标本存放在药学院的标本馆，澳大利亚悉尼大学。

2.3提取过程

将PLR样品在40℃下烘箱干燥24小时。将每个样品研磨成细粉末，并通过180（177mm）筛。取粉末样品（1g）置于玻璃锥形瓶中，并以给定浓度（15.00-50.00％）的固定量（20.00-70.00mL）乙醇浸渍。提取过程在超声波清洗浴（WUC-A03H，Thermoline Scientific，NSW，Australia）中进行，输出功率为300W，照射频率为40kHz。混合物在超声处理浴中40℃下提取特定时间（10.00-30.00分钟）。将混合物冷却至室温，并以10,000g离心10分钟。通过Whatman 1号滤纸过滤上清液在40℃下通过旋转蒸发器在真空下蒸发。干燥的残余物被认为是PLR的乙醇提取物，并在实验前在20℃下储存在玻璃闪烁瓶中。

2.4 响应面方法

中央复合设计（CCD）用于构建三因素，三级可旋转模型由20个实验运行组成，在中心点有六次重复（表1）。实验的顺序是随机的，由于系统错误以最小化选择偏倚以及观察到的反应中不明原因的变异性的影响。提取时间（X1：10.00,20.00和30.00 min）的三个实验因素，乙醇浓度（X2：15.00，32.50和50.00％v / v）和液-固比（X3：20.00,45.00和70.00mL / g）通过响应面进行优化方法。选择人内皮细胞对H2O2诱导的细胞死亡（Y1）的活力作为反应（依赖）变量。将实验数据拟合为如下二阶多项式模型：

其中Y是响应变量，Ao是截距常数Ai; Aii和Aij是线性回归系数，X1的二次和交叉乘积效应; X2和X3因子。Xi和Xj是自变量的编码值，而k等于测试因子的数量（k=3）。使用Mayer及其同事描述的“期望”算法确定最佳提取条件（Myers，Montgomery，＆Anderson-Cook，1995）。为了确定各种组合的可取性，实验变量的“目标类别”设置为“范围”，而响应变量的设置为“最大化”。选择产生最高可取性的实验因子的组合作为最佳提取条件。

2.5测定细胞对氧化应激的活力

在含有15mM HEPES和l-谷氨酰胺的DMEM / Hams F12中，在37℃下将细胞保持在5％CO ₂的气氛中，并补充有10％胎牛血清和100U / mL青霉素和链霉素（Gibco，澳大利亚）。将EA.hy926细胞以1.0times;10 ⁵个细胞/ mL的密度接种在24孔板中，并使其生长直至汇合24小时。将细胞用400mu;l/ mL的PLR乙醇提取物预处理4小时，然后暴露于0.4mM

H₂O₂20个小时，对照组，使用41.41％（v / v）乙醇代替PLR乙醇提取物。

暴露于氧化应激后内皮细胞的细胞活力通过如前所述的MTT染料还原法测定（Kam等，2012）。简而言之，将MTT溶液（5mg / mL）加入到每个孔中，并将板在37℃下孵育4小时。

吸出培养基后，将活细胞内形成的紫色染料晶体溶解于DMSO中，使用微孔板在550nm下测量每个孔的光密度。实验一式三份进行，对照组中甲the的光密度为100％。

表1

三变量三级中心复合材料可旋转设计的响应面方法和相应的响应值

2.6 2,2-二苯基-1-苦基酰肼（DPPH）自由基清除试验

之前的研究采用DPPH自由基清除测定法进行微小修饰（Ahmed et al。，2012）来确定PLR提取物的抗氧化能力。简言之，通过将DPPH溶解在浓度为0.1mM的100％甲醇中制备DPPH自由基溶液。在每个孔中，加入等分试样（200mu;l），将DPPH工作溶液加入100mu;l提取物中。将板剧烈摇动并在室温下在黑暗中孵育30分钟。Trolox用于构建校准曲线，溶液的吸光度在微板读数器上在515nm测量。所有实验一式三份进行。

2.7 UPLC-ESI-MS测量

在色谱分析过程中，将PLR乙醇提取物重新溶解在50.27％乙醇（1 mg / mL）中，并在注射前通过0.22 lm尼龙膜滤膜过滤。液相色谱分析在Waters Acquity超高效液相色谱（UPLC）上进行)H系列系统。使用具有保护柱的Waters BEH C18柱（1.7mm，2.1times;150mm）温度保持在25℃。流动相由（A）在MilliQ水中的（A）0.3％乙酸和（B）0.3％乙酸的乙腈溶液组成，梯度洗脱曲线如下：在0-7分钟内10-25％B，在8-12分钟内25-28％B，7-8分钟28-32％B，12-13分钟32-40％B，13-15分钟40-40％，15-16分钟内40-10％B， 16-20分钟10-10％。流速设定为0.2mL / min，注射体积为0.5mL。

质谱分析在Xevo串联四极杆配有Zspray ESI接口的质谱仪上进行，（UPLC-ESI-QqQ-MS / MS，MA，USA）。在分析之前，应用标准自动调谐调整MS以设置完整质量扫描范围的参数。

选择ESI阳性模式来检测整个实验中的离子碎片。于300℃的温度和流速下使用1000 L / h氮气作为雾化气体。毛细管电压设置为3.5 kV，锥度电压为85 V.以0.5原子质量单位（amu）的质量精度进行所有分析。

2.8 数据分析

ＵＡＥ条件的优化在Design Expert 8.0.5试用版（Stat-Ease Inc.，MN，USA）上进行。为了最小化任何噪音和不一致性，如前所述（Wong，Razmovski-Naumovski，Li，Li，＆Chan，2014; Wong，RazmovskiNaumovski，Li，Li，＆Chan，2013; Wong，Razmovski -Naumovski，Li，Li，＆Chan，2015b）在多变量分析之前。在MATLAB 2011b（TheMathWorks，MA，USA）上进行多变量分析。偏最小二乘回归（PLSR）算法被写为MATLAB m文件，并从PLS工具箱（Eigenvector Research Incorporated，WA，USA）获得。在GraphPad Prism 5（GraphPad）上进行了其他统计分析Software，CA，USA）。P值小于0.05（P lt;0.05）被认为具有统计学意义（Wong et al。，2016）。

结果与讨论

3.1优化UAE条件

3.1.1 响应面模型分析

与一次性一次性优化方法相反，这是费力和耗时的，RSM作为通过减少实验测量数量来调查变量之间关系的理想策略（Picoacute;，2013）。在建立CCD模型之前，进行了一系列初步实验以确定提取参数对人内皮细胞（EA.hy926）对过氧化氢诱导的氧化应激的细胞活力的影响。提取参数，包括提取时间（5.00-50.00 min），乙醇浓度（0.00-100.00％，w / w）和液-固比（10.00-130.00 mL / g）及其与细胞活力的关系在图1中。 S1（补充）。

观察到植物超声处理超过20.00分钟后细胞活力下降，而加水（40.00-60.00％（v / v））有利于提取生物活性成分。增加的液-固比提高了细胞活力，达到80.00 mL / g的平台。结果，提取时间（10.00和30.00分钟），乙醇浓度（0.00和选择50.00％（v / v））和液体至固体（20.00和70.00mL / g）的范围用于随后的实验。

UAE条件的优化使用不同的方式进行根据可旋转CCD模型的可变组合。表1.实验数据经受RSM，适用性的模型通过线性回归和方差分析进行分析并总结在表2中。测定系数（R2）从多个相关系数表示关系在每个二次方程中的预测值和实际值之间。建议来自细胞活力模型（0.9736）的高R₂值观察到和之间存在很高的相关性预测值。评估每个系数的意义通过F检验和学生的t检验。与a相关联的大F值需要小的p值，因为它表明对p的影响各自的响应变量是显着的。 F值来自方差分析显示模型方差的相对贡献到剩余方差。如表2所示，X₁，X₂，X₁X₂，X₁X₃，X²₁，X²₂和X²₃对内皮细胞对氧化应激的影响显着（p lt;0.05）。通过缺乏适合性测试来测量适合度的验证。缺乏拟合的F值和细胞活力模型的p值分别为0.68和0.6590。这些结果暗示，与纯误差相

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