表儿茶素对猪肌原纤维蛋白冷藏过程中氧化诱导的理化和消化率变化的影响外文翻译资料

 2023-03-27 17:06:21

表儿茶素对猪肌原纤维蛋白冷藏过程中氧化诱导的理化和消化率变化的影响

作者：Mingfeng Xu, Manfei Sun, Cairu Lu, Yating Han, Xing Yao, Xiaoying Niu, Maojun Xu and Qin Zhu*

单位：Key Laboratory for Quality and Safety of Agricultural Products of Hangzhou City, College of Life and Environmental Science, Hangzhou Normal University, Hangzhou, 311121, Zhejiang, Peoples Republic of China.

摘要：

背景：研究了表儿茶素（EC）对冷藏期间氧化应激下猪肌原纤维蛋白（MP）理化性质和消化率变化的影响。

结果：MP悬浮液（20mg/mL）培养在哌嗪-N，N0双（2-乙磺酸）缓冲液中，加入0.6 mol/L氯化钠（pH 6.25）在4°C下，在铁催化的羟基自由基生成系统（Fenton反应）下持续24小时，促进硫代巴比妥酸反应物质和蛋白质羰基的形成，其被EC（5、50和100micro;mol /g蛋白质）。EC共孵育发现蛋白质巯基含量降低、色氨酸荧光、蛋白质溶解度降低以及表面疏水性增加。扫描电子显微镜分析显示，氧化MP中的蛋白质聚集和片段增加，添加EC后进一步增强。然而，MP的蛋白质消化率没有受到影响。

结论：EC能有效减轻氧化应激下MP的脂质氧化和蛋白质羰基化。此外，由于可能的酚-蛋白质相互作用，EC掺入后的理化和消化率变化很复杂。深入了解蛋白质的理化性质和消化率变化将有助于将多酚化合物作为抗氧化剂应用于低温加工的肌肉食品中。

关键词：肌原纤维蛋白；氧化表儿茶素；物理化学；消化率

1引言

由于脂肪和蛋白质含量高，在氧化引发剂如肌红蛋白和铁的存在下，肉类和加工肉类很容易氧化。在肉类加工、储存和贸易过程中，脂质和蛋白质中发生的氧化降解会对蛋白质的物理化学和功能特性产生重大影响，并导致营养价值和感官属性的损失。[1-3]此外，这些累积的氧化脂质和蛋白质，以及它们的次级产品，现在被认为是对人类健康的潜在威胁，会影响肉制品的摄入和随后的消化。[4]因此，中断氧化过程并尽量减少不良后果一直具有商业重要性。

随着人们越来越关注合成抗氧化剂作为潜在致癌物，采用天然酚类化合物作为氧化抑制剂的抗氧化策略的设计在生肉以及各种肌肉食品（熟肉饼、法兰克福香肠和干腌肉）中普遍被接受。[1,5]众所周知，天然酚类化合物能够防止脂质氧化，关于它们对蛋白质氧化的抑制作用，已经获得了有争议的结果。据报道，一些酚类化合物在抑制蛋白质氧化方面不如脂质氧化有效，甚至对蛋白质氧化有促进作用。[1,6]例如，在牛肉饼中，加入富含多酚的柳叶草提取物可降低脂质氧化，但加速蛋白质羰基化和变色。[7]在不同酚类化合物对肌原纤维蛋白（MP）氧化的抑制中观察到不同种相互矛盾的作用（抗氧化剂和促氧化剂）。[8]此外，当茶多酚和迷迭香酸被用作抗氧化剂来减弱MP氧化。[9,10]得出结论，天然酚类化合物作为抗氧化剂或促氧化剂的作用取决于内部因素，如化学结构和外部因素，包括氧化条件、酚类化合物的定位和浓度及其与蛋白质分子的相互作用等。[11–13]因此，天然酚类化合物在肉制品中的应用是当前的科学挑战。

在各种天然酚类抗氧化剂中，茶儿茶素（黄烷-3-醇的单体、低聚物或聚合物）因其受欢迎、有效的抗氧化性能和促进健康的作用而受到广泛关注。有几份报告研究了茶儿茶素作为肉制品食品添加剂的效果。观察到脂质氧化和蛋白质氧化减少，而有关蛋白质理化和消化特性变化的信息相当有限。[14,15]本研究的目的是评估表儿茶素（EC）在铁催化羟基自由基生成系统（Fenton反应）下对MP氧化的影响。分别通过硫代巴比妥酸反应物质（TBARS）和蛋白质羰基化的定量研究EC对脂质和蛋白质氧化的抑制效果。EC对MP理化性质的影响表现为总巯基、表面疏水性、固有荧光和蛋白质溶解性。此外，还对MP的蛋白质表面微观结构和蛋白质消化率的变化进行了评估。所得结果有望加深我们对EC在MP氧化过程中的作用的理解，这可能有助于提出合适的预防方法，以减轻氧化对肌肉食品的有害影响。

2.材料和方法

2.1 材料

新鲜猪肉（背最长肌）从当地一家屠宰场获得，并按照标准工业程序屠宰猪。屠宰后冷藏24小时后，去除可见脂肪，并将单个肌肉样品（约200克）真空包装并储存在室温下minus;使用前80°C（3天内使用）。EC、哌嗪-N、N0-双（2-乙磺酸）（管道）、亚乙基双（氧亚乙基亚硝基）四乙酸（EGTA）、1-苯胺基-8-萘磺酸酯、5,50-二硫双酚（2-硝基苯甲酸）（DTNB）、表儿茶素、1,1,3,3-四甲氧基丙烷（TMP）、猪胃蛋白酶（250单位mg-1固体）和胰酶（8times;USP规格），L-抗坏血酸均从SigmaAldrich（美国密苏里州圣路易斯）获得。牛血清白蛋白（BSA）、磷酸二氢钠、三氯乙酸（TCA）、亮蓝R250、2,4-二硝基苯肼（DNPH）、氢氧化钠（NaOH）、硫代巴比妥酸（TBA）、乙腈、氯化钠（NaCl）、三氯化铁、氯化镁（MgCl2）、过氧化氢（30%），所有其他分析级试剂均从国药集团化学试剂有限公司（中国上海）购买。

2.2 分离MP

MP的提取采用Park等人[16]的程序。首先将肌肉样品切成小块，然后用含有10 mmol/L磷酸钠，1 mmol/L EGTA，2 mmol/LMgCl2和0.1mol/L氯化钠的四体积（v/w）MP分离缓冲液（pH 7.0）均质1分钟。整个提取过程在冰上进行。在2000times;g离心20分钟后丢弃上清液，并用四体积相同的MP分离缓冲液洗涤粗MP颗粒几次。随后，使用四层粗棉布过滤MP悬浮液以去除结缔组织。用0.1mollminus;1盐酸（盐酸）调节滤液pH至6.25后离心。采用双缩脲法测定MP的蛋白质浓度，并用BSA建立标准曲线。获得MP颗粒，并将其紧紧保存在冰上的螺旋盖玻璃瓶中，并在24小时内使用。

2.3 氧化处理

按照Cao等人[17]的方法，将MP悬浮液(最终浓度为20mg/mL，含0.5mg/mL叠氮化钠)分散于15mmol/L管缓冲液(含0.6mol/L叠氮化钠)。EC(最终浓度分别为5、50和100mu;mol/g蛋白)通过涡旋均匀地应用于MP悬液中。使用羟基自由基生成系统（Fenton系统，含10mu;mol/L氯化铁（III），100mu;mol /L抗坏血酸和1 mmol/L过氧化氢）在4°C下氧化不同处理（10 mL），并在步入式冷室中持续振荡24小时。同时制备未经氧化处理的MP对照品。

2.4 脂质氧化测定

经过大量提取程序后，MP中仍含有0.49%的脂肪（干基），其中大部分是膜磷脂。[18]在芬顿体系中，MP中的残余脂质容易氧化。根据Salih等人[19]的程序，采用TBARS法测定MP样品中的脂质氧化产物。简单地说，将等体积的MP样品与含有15%TCA、30%TBA和0.25 mol /L的TBA试剂混合HCl，并允许反应在95°C下进行30分钟。使用带粉红色的上相测量试剂空白在532 nm处的吸光度。通过TMP在水溶液中的水解，建立了脂质氧化副产物丙二醛（MDA）的标准曲线。TBAR的量以每克样品蛋白质的毫摩尔MDA当量计算。

2.5 蛋白质羰基化

按照Levine等人[20]的程序，采用DNPH衍生法测定不同处理中MP的蛋白质羰基含量。氧化处理后，取0.1 mL样品等分（稀释至5 mg/mL蛋白质）用0.2mL DNPH溶液（0.1%w/v，2mol /L衍生HCl）在室温下黑暗中1小时。衍生化后，用TCA（0.2 mL，20%w/v）沉淀蛋白质并离心（5000times;g，10分钟）。用乙酸乙酯/乙醇（1:1，v/v）的混合物洗涤沉淀物，直到上清液无色。最后，将所有样品溶解在8 mol/L溶液中盐酸胍溶液。蛋白质羰基含量在370nm处测定，对照热科学Varioskan上经HCl处理的空白蛋白质样品trade;闪光光谱扫描多模阅读器（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市赛默科学公司）。由于在不同洗涤步骤中可能会损失一些蛋白质，因此通过构建BSA标准曲线，在280nm处同时记录MP样品的蛋白质含量。蛋白质羰基含量表示为每毫克蛋白质的纳摩尔DNPH，吸收系数为22 000 molminus;1cmminus;1用于蛋白质腙。

2.6 总巯基

根据Ellman方法，使用DTNB测定不同处理中MP的总巯基含量。[21]简言之，将100mu;L蛋白质样品溶解在200mu;L尿素/十二烷基硫酸钠（SDS）溶液（pH 7.4）中，其中含有8 mmol/L尿素，0.03g/mL SDS和0.1 mol /L磷酸盐缓冲液。然后向混合物中添加50mu;L 10 mmol/L DTNB溶液，并在25°C的黑暗中培养15分钟。在412 nm处测量UV吸光度，同时记录试剂和样品空白。结果通过13600 L mol-1CM-1的摩尔消光系数计算得出总蛋白质巯基含量。

2.7 表面疏水性

根据Chelh等人[22]的方法，使用溴酚蓝（BPB）测量不同处理之间MP表面疏水性的变化。简单地说，1毫升MP悬浮液与0.2毫升BPB（1毫克/毫升）充分混合、溶解于

蒸馏水。由磷酸盐缓冲液（20 mmol/L）组成的对照组不含MP也与BPB混合。对照组和样品在室温下放置10分钟，离心3000times;g15分钟，得到的上清液稀释十倍，紫外吸光度记录在595 nm处，对照空白（磷酸盐缓冲液）。蛋白质表面疏水性以BPB结合（以微克为单位）表示，其中A表示吸光度。

BPB结合（mu;g）=200times;（A595空白minus; A595样品）/A595空白。

2.8 固有色氨酸荧光

根据Esteacute;vez等人的方法测定MP固有色氨酸的变化。[23] MP悬浮液稀释至0.4 mg mL的浓度minus;1管缓冲液（含0.6 mol Lminus;1氯化钠，pH值6.25）。在283 nm处激发MP悬浮液，使用Varioskan仪器记录300至400 nm范围内的发射光谱曲线trade; 闪光光谱扫描多模阅读器（Thermo Scientific）。在相同条件下，记录并减去不同处理的背景光谱。

2.9 蛋白溶解度

MP样品的溶解度由Uterra和Esteacute;vez描述的方法[24]测定。首先用含0.6molLminus;1氯化钠(pH6.25)的25mmolLminus;1磷酸盐缓冲液将24MP悬浮液稀释至2mgmLminus;1，然后在4000times;g下离心(4°C)20min。MP的蛋白溶解度以上清液的蛋白浓度与原MP悬液的蛋白浓度的比值计算。采用双脲脲法测定蛋白质浓度。

2.10 扫描电子显微镜（SEM）

利用扫描电子显微镜（SEM；日立S-4800，日本东京）研究了不同处理下MP的表面微观结构。蛋白质固定在导电塑料带上，然后溅射镀金。这些涂层MP样品均在相同的放大倍数下进行观察，放大倍数为10000倍，加速电压为10kV。

2.11 体外消化的评价

根据Cao等人[17]的方法测定蛋白质消化率。样品悬浮在盐酸溶液中（10 mmol/L） ，然后加入1毫克毫升minus;1胃蛋白酶溶液（溶于10 mmol/L盐酸）。MP的最终浓度调整为4 mg/mL在混合溶液中（胃蛋白酶10 U mgminus;1，蛋白质基础，pH值2.0），并开始培养，以模拟37°C条件下的胃消化1小时。用1molLminus;1氢氧化钠将pH调整至7.4以灭活胃蛋白酶，在37°C下立即加入胰酶(4%w/w蛋白基)开始肠道消化至2小时。添加30%TCA溶液，最终终止整个消化过程。在胃消化和肠消化结束时，取不同处理的等份进行生化分析。消化物在4°C下以10000times;g离心15分钟。沉淀物溶解在NaOH（1 mol Lminus;1） 双缩脲法不能用于测定MP蛋白浓度。不同处理中MP的消化率通过以下公式计算。总蛋白浓度和TCA沉淀蛋白浓度分别表示为Ct和Cp：

消化率(%)=(Ct-Cp）/Ct

2.12 统计分析

对三批不同处理的MP悬浮液进行测试，所有数据均以平均值plusmn;标准偏差（SD）表示。使用SPSS统计软件包（美国伊利诺伊州芝加哥市SPSS公司）进行统计分析。Duncan检验用于比较不同处理之间的值，显著性定义为Plt;5%。

3结果和讨论

3.1 MP中的脂质氧化

经过广泛的分离和洗涤过程后，MP中残留有膜磷脂（约0.49%脂肪，干基）。这些残余脂质易受Fenton反应产生的羟基自由基（bull;OH）引发的氧化影响，产

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