南非药用植物对真菌毒素产生真菌的抗真菌、抗氧化活性及细胞毒性研究外文翻译资料

 2023-03-28 17:01:00

南非药用植物对真菌毒素产生真菌的抗真菌、抗氧化活性及细胞毒性研究

作者：N.I.Mongalo, alowast;,P.M.Dikhoba b, S.O.Soyingbe b,T.J.Makhafola b

单位：University of South Africa,College of Agriculture and Environmental Sciences Laboratories,Private Bag X06,Florida,0610,South Africa

摘要：

已知属于镰刀菌属和曲霉菌属的真菌菌株会感染作物，导致粮食安全受到威胁和农业作物产量下降。本研究旨在研究选定南非药用植物提取物的抗真菌毒素活性、细胞毒作用和抗氧化潜力。研究了选定药用植物叶片的水提取物和有机提取物对已知会感染作物和产生真菌毒素的各种真菌菌株的抗真菌活性。并评价了抗氧化活性、酚类和黄酮类总含量。大百合有机提取物，对赭曲霉、对小麦镰刀菌和尖孢镰刀菌的最低抑菌浓度（MIC）值最低，为0.01mg/mL。一般来说，有机提取物比水提取物具有显著的抗真菌活性。Carpobrutus eludis L.和萨卢塔里斯沃布贾（G Bertol)Chiov发现了一种强大的细胞毒性作用，可产生50%的致死浓度（LC50）对于真皮和Vero细胞的作用分别为0.01mg/mL。黎西努斯CamuisL发现50%的抑制浓度（IC50）的价值对2,2二苯吡啶肼（DPPH）的浓度有945mg/mL。一般来说，植物类黄酮含量低于酚类。所选植物提取物的生物活性可能与酚类物质含量高有关。

关键词：植物生物学

1引言

腐生真菌通过食物对人类和动物的健康构成了主要威胁，在采前和采后的[1]期间的腐败和随后的霉菌毒素污染。由于其无处不在的性质，这些真菌菌株感染和污染各种各样的粮食作物，难以控制。不良的收获做法、不适当的干燥、处理、运输和储存材料使用导致真菌生长和增加霉菌毒素生产的机会，这可能直接对受影响地区[2]的经济产生负面影响。高温、水分、加工和暴雨也有利于真菌生长[3]。在发达国家，食品中的霉菌毒素水平使用各种最新的技术工具、不同的质量标准和推荐的每日摄入量水平[4]进行调节。然而，重要的是要注意，这些方法可能不适用于大多数农村社区，在发达国家和不发达国家依赖农业食物[5]。

据估计，到2050年[6]，全球粮食产量将增长50%，以满足世界人口的需求。由于人类种群可能很大程度上取决于食品生产系统的条件，这可能不是由于真菌毒素真菌菌株产生的，主要属于镰刀菌属、曲霉属[7]。这一问题是造成若干毁灭性感染和各种致命的人类疾病的普遍和经常公认的原因之一。这些菌株在大多数非洲国家的玉米、水稻和小麦等主要农产品的污染和数量降解中发挥作用。来自这些属群的真菌物种已知产生多种真菌毒素或次生代谢物，一个菌株可以同时产生一个以上的真菌毒素[8,9,10,11]。这些物种产生的最常见的霉菌毒素包括伏马菌素、黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、青黄酮和毛霉素[12]。人类接触霉菌毒素可能主要是通过直接食用受霉菌毒素污染的作物和动物基产品，吸入和通过皮肤[13]直接接触。

自由基，如活性氧（ROS)、活性氮（RNS）和活性氯（RCS)，都是由包括呼吸链在内的各种生化反应在体内产生的。这些分子被引入从外界环境如紫外线（紫外线）、辐射、吸烟、空气污染、不健康食品、压力、某些药物等。自由基分子在人体内的积累可能导致细胞损伤，导致人类和动物的各种疾病。本文旨在研究南非药用植物对曲霉菌和重要食物污染真菌菌株的抗真菌毒素潜力。此外，为了探索这种植物提取物对2,2二苯基吡啶肼（DPPH) 的抗氧化性能。具有良好的抗真菌和抗氧化活性的植物提取物可以很好地防止食品氧化引起的腐败。这些真菌菌株很可能通过产生各种毒素来促进食品中的氧化。

2.方法

2.1植物材料和研究区

所选择的药用植物，随机从夸祖鲁－纳塔尔省北部夸兰格兹瓦附近村庄的野生地区采集新鲜和健康的叶片（表1）。如本研究选择文林德拉、伊尼维、埃西卡莱尼、翁戈耶、阿曼齐南山和因达巴亚河。虽然传统医学通常使用根和茎来治疗各种感染（表1），但本研究选择了叶片作为研究对象，为生物多样性提供保护措施，以防止野生重要植物种群的退化和灭绝。

表1.对选定的药用植物的民族植物学用途.

将叶片分别收集到棕色纸袋中，在室温下通风良好的实验室工作台上干燥， 以确保有效干燥而不受微生物攻击，然后使用锤磨机（IKA科学，MF10B型，德国） 磨成粉末（2毫米网）。然后，这些粉末被储存在密封的塑料瓶中，直到需要时拿出。这些标本是由佛罗里达校区生命与环境科学系的植物学家（MondeNyila博士）收集、制作和鉴定的。标本在植物标本室验证比勒陀利亚的强度与代码PRU。另一个标本被保存在UNISA处，代码为UNI。将叶子收集到小包里，在15摄氏度下干燥。

2.2植物材料的提取物

干燥的植物材料分别用热水和1：1甲醇：二氯甲烷（AR级）提取。水提物以1： 5w/v煮沸，在实验室工作台上冷却，通过霍特曼的No.1过滤纸和冻干（Labconco公司，堪萨斯城，穆苏里州，美国）。有机提取物以1：10w/v提取，在摇床培养箱（科学，美国）以100rpm保存过夜，然后通过Whatmansno1纸过滤，然后用布基旋转蒸发器浓缩(毕比科学有限公司，斯塔福德郡，英国)，将得到的水溶液和植物提取物称重，然后保存在4℃的冰箱中。

2.3 选定真菌菌株

选用真菌属真菌（fusaium - rium）和曲霉菌（Aspergillus）等6株植物病原真菌进行抑菌活性试验。 所选品种为黄曲霉菌（Furasium verticillioides, PPRI 10148)、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum, PPRI 10185)、禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum, PPRI 10340)、寄生曲霉菌（Aspergillus parasiticus, PPRI 9153)、黄曲霉菌（Aspergillus flavus, PPRI 14636）和黑曲霉菌（Aspergillus ochraceous, PPRI 6816)。 真菌菌株于2015年（南非比勒陀利亚）从农业研究委员会－植物保护研究所（ARC-PPRI）购买。

2.4抗真菌活性

采用Eloff[27]法测定了选定的药用植物提取物的抗真菌活性。所有的生物用新鲜制备的纱布和葡萄糖琼脂保存。用新鲜的葡萄糖肉汤（南非默克公司） 稀释至浓度约为1.1107cfu/mL。不久，从10mg/ml的无菌蒸馏水中连续稀释2倍，测定所选药用植物提取物的最低抑菌浓度（MIC）值。然后在所有孔中加入约100mL的标准化真菌培养物，得到的植物提取物浓度最高，为0.25mg/mL。在稀释的植物提取物中加入约40ml碘四氮氯铵（INT）0.2mg/mL，紫色的孔显示真菌的生长，而无色或绿色表示提取物抑制真菌的生长，并发现最低抑菌浓度（MIC)。在24和48小时后读取结果。

2.5细胞毒性研究

使用Mosman[28]四唑比色法（MTT)，测定了1：1甲醇：二氯甲烷提取物（德国）的牛真皮和Vero细胞的细胞毒性。提取液在100mg/ml的浓度下制备，在DMSO中溶解，在DMEM中溶解，最终最高浓度为1mg/ml。收集融合培养的细胞，以100xg离心5min，然后重新悬浮于生长培养基中，浓度为5104cells/ ml.使用的生长培养基为添加0.1%庆大霉素（Wirbac）和5%Harbad血清（胎儿生物）。将约200毫升的细胞悬液移液到96孔无菌微滴度板的2至11柱的每个孔中。在1号柱和12号柱的井中加入MEM(200ml)，以尽量减少“边缘效应”并保持湿度。将培养皿在37C、5%CO下孵育24小时直到细胞处于指数生长阶段。从细胞中抽出MEM，然后用150ml磷酸盐缓冲盐水（PBS，whitehead科学）洗涤，用200ml不同浓度的试验丙酮提取物替换，重复四次。在MEM中制备了试验提取液的连续稀释液。在吸入培养基和添加测试物质的过程中，细胞受到尽可能少的干扰。微滴度板在37C的5%CO中孵育，用试验化合物或药用植物提取物培养箱48h。未处理的细胞和阳性对照，包括阿霉素（辉瑞实验室）。孵育后，在每孔中加入30mlMTT（Sigma，5mg/mlPBS原液），在37C下再孵育4小时。 用MTT孵育后，小心地取出每个孔中的培养基，而不干扰MTT井中的晶体。每孔加入50mlDMSO，溶解MTT甲瓒晶体。轻轻地摇动盘子，直到MTT溶液溶解。通过检测590nm波长的微板阅读器（阿姆斯特丹私人有限公司）的吸光度，立即测量MTT的还原量。第1列中含有培养基和MTT但没有细胞的孔被用于空白平板阅读器。LC50该值计算为测试植物组分或分离化合物的浓度，与未处理的细胞相比，吸光度降低了50%。提取物的选择性指数计算如下：选择性指数（SI)frac14;LC50以mg/mL/MIC在mg/mL中，48小时孵育时间[29]。

2.6DPPH检测

采用布兰德－威廉姆斯等人的[30]方法，测定了有机提取物的DPPH自由基清除活性。

在本研究中，由于自由基较其他方法更稳定，因此仅采用DPPH试验，因此可作为抗氧化试验的代表性模型。不久，将75mg的DPPH溶于100mL的甲醇中。植物提取物被制成一种溶液浓度为5mg/ml，在DMSO中溶解。在96孔板中加入约150mL的DMSO，在第一孔中加入等量的植物提取物，然后两倍连续稀释。然后在所有井中加入约150mL的DPPH溶液。平板在黑暗中孵育1 小时，然后使用酶标仪（VarioskanFlash，AEC阿姆斯特丹私人有限公司）在517nm波长下读取。以抗坏血酸为阳性对照，以甲醇和DMSO为阴性对照指令控制。抑制百分比的计算公式如下。清除能力frac14;OD样品=Od样本空白/OD控制空白times;100%。植物提取物的浓度导致DPPH(IC降低50%)，然后根据对植物提取物浓度的抑制作用百分比构建的线性图来确定。

2.7总酚类物质含量的测定

采用Makkar[31]所述的福林－钙提法测定所选药用植物有机提取物的总酚含量。简单地说，用25mL植物粗提取物（0.5mg/ml），用250mL植物粗提取物试剂处理5min。加入约750mL20%无水碳酸钠后，反应停止。用蒸馏水配制体积至5mL，室温黑暗孵育2小时。孵育后，在760nm处读取吸光度分光光度计（Varioskan闪光灯，AEC阿姆斯特丹私人有限公司）。根据不同浓度DMSO的标准曲线测定酚类含量。结果用mg/g（GAE）表示。

2.8总类黄酮含量的测定

有机提取物中总类黄酮含量采用Yadav和Agarwal[32]的方法测定。将0.5mg/ml(100mL）的粗提物溶解在300mL的甲醇中，其中加入20mL10%的氯化铝。再向溶液中加入20mL1M醋酸钠。所得溶液用蒸馏水配制至1mL。在室温下孵育30min。孵育后，吸光度为450nm波长读取（Varioskan闪光，AEC阿姆斯特丹私人有限公司）。以槲皮素（10mm）为标准。各提取物类化合物含量以mg/g槲皮素量（QE）表示。

2.9统计分析

本研究的结果采用方差分析法进行了分析。在抗真菌研究中，结果记录为三个独立实验的平均值，而细胞毒性、抗氧化活性和总酚类和总黄酮含量的结果报告为平均SE(nfrac14;3)。 P值为p0.05被称为显著的。

3结果和讨论

3.1抗真菌活性

霉菌毒素是一些丝状真菌产生的次生代谢物，由于真菌的生长，可以在食物上产生。当这些毒素被人类和动物摄入时，它们可能会导致包括肝脏和肾脏功能障碍在内的疾病。引起重大健康危害的重要霉菌毒素是黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A、柠檬素、镰刀菌毒素、帕图霉素和齐拉勒烯酮[33]，镰刀菌和曲霉感染多种农产品，包括玉米、谷物、花生、高粱、坚果、肉类、鸡蛋和本地蔬菜， 包括“morogo”[34,35]。

表2.南非药用植物对农业相关致病原株的抗真菌活性（mg/ml MIC）

来自镰刀菌属和曲霉菌属的腐生真菌菌株是霉菌毒素的高产生产者，其中包括真菌毒素和各种真菌毒素[36]。本文报道了南非水溶液和有机植物提取物的抗真菌活性的结果（表2）。寄生曲霉是对有机植物提取物最敏感的真菌菌株， 平均MIC值为0.22mg/mL。A的一些突变株。寄生虫已被报道具有高突变频率和产生更高产量的黄曲霉毒素，并对市场上已经有的其他几种杀菌剂越来越具有抗药性。这些菌株被认为具有

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