芳樟醇、柠檬烯和香桧烯对丙二醛诱导氧化应激下兔肉肌原纤维蛋白热稳定性和结构的影响外文翻译资料

 2023-03-28 17:04:48

芳樟醇、柠檬烯和香桧烯对丙二醛诱导氧化应激下兔肉肌原纤维蛋白热稳定性和结构的影响

原文作者：Zefu Wang a, Zhifei He a,b, Dong Zhang a, Xiaosi Chen a, Hongjun Li a,b,*

单位：College of Food Science, Southwest University, No.2 Tiansheng Road, Beibei District, Chongqing, 400715, China

摘要：本研究旨在评价花椒主要成分的保护作用。精油(ZBMEO)对 MDA(丙二醛)诱导氧化作用下兔肉肌原纤维蛋白(MP)特性的影响。在 MDA 诱导的氧化作用下，将 MP 悬浮液与不同浓度(5 mM、25 mM 和 50 mM)的芳樟醇、柠檬烯、香桧烯混合。测定了残留丙二醛含量，分析了兔肉肌原纤维蛋白的热稳定性和结构。芳樟醇、柠檬烯、香桧烯能有效阻止 MDA 与 MP 结合。与对照 MP 相比，芳樟醇、柠檬烯和桧烯的加入导致巯基和游离胺含量增加，羰基含量和表面疏水性降低。此外，在丙二醛诱导的氧化作用下，该添加剂对维护 MP 的二级结构和形态也有保护作用。差示扫描量热法(DSC)和 SDS-PAGE 分析表明，芳樟醇、柠檬烯、桧烯对 MHC 和肌动蛋白有明显的保护作用。以上结果表明，芳樟醇、柠檬烯和桧烯可以减轻丙二醛对 MP 的氧化损伤，可能具有保护食品中蛋白质结构和理化性质的潜力。

关键词：丙二醛诱导的氧化； 花椒精油； 兔肉肌原纤维蛋白；保护作用；结构

1. 介绍

兔肉及其制品因其胆固醇含量低、富含多不饱和脂肪酸和蛋白质而受到消费者的欢迎(Wang, Tang, et al., 2020)。但兔肉易变质，主要是由于微生物腐败、脂质和蛋白质氧化造成的(Van et al., 2017)。蛋白质氧化影响肉的质地、口感、风味、可接受性和营养价值 (Li, Wang, Kong, Shi, amp; Xia, 2019; Pomponio amp; Ruiz-Carrascal, 2017; Wang, He, Emara, Gan, amp; Li, 2019)。因此，控制蛋白质氧化对鲜肉保鲜具有重要意义。

目前，研究主要集中在天然抗氧化剂对肉类中蛋白质氧化的影响，天然抗氧化剂主要包括植物提取物和精油 (Wang, He, Zhang, amp; Li,2021；Brewer, 2011)。一些研究已经直接将天然抗氧化剂添加到肉的复杂系统中，以观察天然抗氧化剂对蛋白质氧化的影响，并且其他研究已经证明天然抗氧化剂通过清除自由基来抑制蛋白质氧化(Pateiro et al.,2018; Sadeghinejad, AminiSarteshnizi, AhmadiGavlighi, amp;Barzegar, 2019)。

蛋白质和脂质氧化在肉系统中共存并相互促进，同时，脂质氧化产物可诱导蛋白质氧化(Wang, Zhao, Qiu, amp; Sun, 2018)。丙二醛(MDA)是多不饱和脂肪酸氧化的主要次级产物，有研究者观察到MDA可以促进蛋白质氧化(Traverso et al., 2004; Wang et al.,2019)。因此，除了清除自由基外，天然抗氧化剂可能通过影响脂质氧化的机制来控制蛋白质的氧化。

花椒，是芸香科的花椒属，是中国烹饪中使用最广泛的辛辣香料之一(Chen et al., 2018)。花椒精油(ZBMEO)是通过水蒸馏或超临界流体CO2萃取法从 ZBM 提取的(Zhang, He, Li, amp; Wang,2017)。现在，ZBMEO已经被用于肉类的抗氧化，它还具有清除自由基的能力 (Dannenberg, Funck, Silva, amp;Fiorentini,2019；Ma, Wang, Li, Hou, amp; Wei, 2019)。在此基础上，本研究提出了一个假设，即 ZBMEO 的化合物可能通过非共价键和共价键与丙二醛相互作用，阻止丙二醛与蛋白质官能团结合，从而在丙二醛诱导的氧化应激下保护性地影响肌原纤维蛋白的结构和功能特性。

因此，本研究的目的是利用气相色谱-质谱联用技术分析 ZBMEO 中的主要化学成分，然后向 MDA 诱导的 MP 氧化体系中添加优势化合物。通过羰基、巯基、游离胺和固有色氨酸荧光的测定，分析了 MP 结构特征的变化。此外，还对其表面疏水性、热稳定性、粒径和拉曼光谱进行了研究。

2. 材料和方法

2.1 材料

ZBMEO购自广州天旭食品添加剂有限公司(中国广州)。在分析之前，将油储存在4℃下。新鲜胴体(公兔，2.3-2.5 kg/只活兔，屠宰4h后)购自中国重庆阿星记食品有限公司。在4小时内，尸体被立即装在一个冷冻箱(约6℃)运送到实验室，然后用刀对胸腰段(LTL)进行解剖，并包装在聚乙烯袋中。样品在4℃下老化24h以消散尸僵，然后储存在-30℃冰箱。

ZBMEO样品采用气相色谱-质谱联用(Shimadzu公司，2010)，采用火焰离子化检测器和HP-5MS (30 m times;0.25 mm times;0.25 mu;m)毛细管柱，采用Ahmed和Tavaszi-Sarosi(2019)的方法进行分析。温度被编程为在50℃等温设定2分钟，以2℃/min的速度从 50℃增加到 150℃，在150℃下保持2分钟，以10℃/min的速度从150℃增加到250℃，并在250℃下保持5分钟。注射器温度为250℃，氦气流量 (载气)为 1.0 mL/min。样品被稀释(1%溶液，v/v，在己烷中稀释)， 然后以分流模式手动注入。ZBMEO(图 S1)中检测到三种主要化合物(芳樟醇、柠檬烯和桧烯)，其标准品(纯度gt; 98%)购自阿拉丁公司(中国上海)。其他的化学品属于分析级或更高级别。

2.2 丙二醛溶液的制备

采用Wang et al.(2019)的方法制备MDA溶液。简单地说，将8.4 mL 1,1,3,3-四甲氧基丙烷放入加入10 mL 5 M盐酸和31.6 mL蒸馏水的棕色试剂瓶中。然后将混合物在黑暗中于50℃下孵育60分钟。通过加入6 M NaOH溶液，将所得混合物的pH调至6.0，制成MDA溶液。使用摩尔消光系数(31500 Mminus;1cmminus;1)，通过紫外分光光度计测量267 nm处的吸光度来评估MDA浓度。

2.3 MP的提取

将冻肉试样置于4℃下8h后，用专业绞肉机将其切碎，提取MP。MP的提取方法采用Cao and Xiong(2015)的方法，MP保存在一个4℃的密封瓶中，在24小时内使用。

2.4 MP的处理

MP悬液(20mg/mL)在20mM磷酸盐缓冲溶液中制备(含0.6M氯化钠，pH6.0)。未添加任何成分的MP悬液为空白组，仅添加5 mM MDA的MP悬液为对照组。将三种主要的ZBMEO组分（芳樟醇、柠檬烯和桧烯）加入MP悬浮液中，作为MDA系统(5mM)氧化胁迫的处理组，每种添加剂分别为3种浓度(5mM、25mM和50mM)。所得混合物在黑暗中于 4℃孵育 24 小时。为抑制微生物的生长，每组均加入0.02%的叠氮化钠。

2.5 残留丙二醛含量的测定

将混合的 MP 悬浮液离心(5000g，15min，4℃)并收集上清液，然后将糊状物加入5体积的蒸馏水并均质化(10000 rpm，60s)。离心所得匀浆(5000g，15min，4℃)和上清液被收集起来。这个过程重复3次，所有的上清液都巩固到恒定体积为1L。游离MDA含量按Wang, He, Zhang, Li, and Wang(2020)等方法进行测定。保留的MDA含量等于添加的MDA含量减去游离MDA含量。

2.6 MDA-MP加合物的荧光光谱分析

采用Traverso等人(2004)的方法测定了MDA-MP加合物的荧光光谱。简单地说，MP样品用20mM磷酸盐缓冲液(pH6.0)稀释至0.5mg/mL。光谱由荧光分光光度计(F-2000，日立，日本)测量，并在400~600nm范围内记录。

2.7 氧化变化评价

2.7.1 羰基测量

MP 的羰基含量根据 Shen, Huang, Zhao, and Sun (2019)所述的方法估算。简单地说，MP样品与2,4-二硝基苯肼(DNPH)混合，孵育30min。然后加入20%的三氯乙酸沉淀MP。通过离心法收集沉淀的MP颗粒，并用乙醇/乙酸乙酯(1：1，v/v)溶液洗涤三次，以去除残留的DNPH。然后将样品溶解于磷酸盐缓冲溶液中（含6M盐酸胍）。最终溶液在370nm处测定，羰基含量表示为 nmol 羰基/mg 蛋白质。

2.7.2 巯基测量

采用Pan等人(2020)的方法测定MP中的巯基含量。MP 样品与5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)在40℃下反应 30min。记录 412nm 处的吸光度。使用摩尔消光系数 13,600 Mminus;1 cmminus;1计算巯基含量。

2.7.3 游离胺测量

游离胺含量的测定采用Lv等人(2019)的方法进行分析。简单地说，将1 mL MP样品(1 mg/mL)与6 mL邻苯二甲醛溶液(0.8 mg/mL, 50 mM Na2B4O7, 0.5 mL beta;-巯基乙醇(beta;-ME)和1.25 g SDS, pH 9.75)混合。在340nm处测定MP样品的吸光度，用甘氨酸标准液测定游离胺含量。

2.7.4 表面疏水性

采用Xu等人(2020)描述的溴酚蓝(BPB)方法测定了MP样品的表面疏水性，并进行了一些修改。简而言之，将MP样品用20mM磷酸盐缓冲液(pH6.0)稀释至5mg/mL，1mL MP稀释液与0.2mL BPB溶液(1g/L)混合。室温孵育30min后，将混合物以5000times;g离心15min。获得的上清液稀释10倍，用紫外-可见分光光度计(紫外-1700，日本岛津)在595nm对空白液进行测定。蛋白质表面疏水性用结合BPB(ug)表示，如下式：

BPB(ug) = 200 ugtimes;(A对照-A样品)/A对照

2.8 拉曼光谱学

MP的拉曼光谱是按照Tang等人(2017)的方法测量的，但稍作修改。样品采用Thermo Fisher Scientific DXR2光谱仪分析(美国)，每个样品重复3次。每个光谱的扫描范围为4000 ~ 500 cmminus;1，光谱分辨率为5 cmminus;1。使用OMINC软件(TQ分析人员，Thermo Fisher Scientific)，基于拉曼光谱中的特征峰对拉曼光谱进行了集成。

2.9 荧光光谱学

将MP样品稀释至0.5mg/mL，用荧光光谱仪(F-2000，日本日立)测量MP样品的荧光。激发波长设置为295nm，发射光谱记录范围为310~450nm。激发缝和发射缝均设置为10nm，激发电压为400V，扫描速度为1500nm/min。

2.10 粒径分布与共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)

用Mastersizer 2000(Malvern仪器，英国)在室温下测量了处理后的MP溶液样品的粒度分布。

用共聚焦激光扫描显微镜观察了处理后的MP样品的微观结构。MP样品用荧光素异硫氰酸酯(20mg/L)染色。染色后的样品被放置在显微镜下的载玻片上。乳剂的CLSM图像由共聚焦激光扫描显微镜 (ZEISS LSM800, Carl Zeiss, 德国)记录。

2.11 差示扫描量热法(DSC)

采用差示扫描量热计测定了MP样品的热稳定性。将MP浓度调整到20mg/mL，然后将10-12mg样品准确称重到铝锅中并密封，用空铝锅作为参考。热扫描采用差示扫描量热计 (美国TA仪器公司股份有限公司，DSC25) 以10℃/min的速率在30~100℃之间进行热扫描。用 TRIOS 软件测量了 MP 样品的变性温度(Td)。

2.12 SDS-PAGE

将MP样品溶解在pH值为6.0(含0.6M氯化钠)的20mM磷酸盐缓冲液中，得到2.0mg/mL的MP溶液。将MP溶液与样品缓冲液以1:3的比例混合。在沸水中加热3min后，将所得混合物以3000g离心5min。使用Bio-Rad实验室（(Rich-mond,，加州，美国）提供的仪器，在30mA的恒定电流下进行电泳4小时。样品用10%的流动凝胶进行分离。电泳后，用考马斯亮蓝R-250溶液染色凝胶1小时，然后在另一种溶液（甲醇:冰醋酸:蒸馏水=1:1:8[v/v/v]）中染色3小时。用一个蛋白质标记物(范围从5kDa到245kDa)来测定其分子量。

2.13 统计分析

所有的测量结果包括3个独立的实验，每个重复测量三次。数据以平均值plusmn;标准误差表示，并采用统计分析软件(SPSS 22.0, USA)进行分析。均数之间的方差分析采用Duncan多范围检验(P lt; 0.05)，以确定显著性差异。

3. 结果和讨论

3.1 MP与MDA的结合

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