英语原文共 13 页，剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料
基于微流体装置的循环肿瘤细胞分选仿生脾鞘内裂隙列
Jianfeng Chensup1;rsquo;sup2;▪Zefan Yangsup1;▪Wenhu Xusup1;rsquo;sup2;▪Meirong Yisup1;rsquo;sup2;▪Min Zhongsup1;rsquo;sup2;▪Xiaobing Lisup1;rsquo;sup2;▪Hongwei Tiansup3;
收稿日期：2021年2月5日/接受日期：2021年6月7日/在线发布日期：2021年6月12日
copy;作者，获得斯普林格-弗拉格德国有限公司独家授权，该公司是斯普林格Nature2021的一部分
摘要
本文研究了一种基于仿生脾窦微结构的微流控分选方式来捕获循环肿瘤细胞（CTCs）。建立了一个动态多相流模型，以探讨不同的流动和内脾间隙（IES）的脾脏异性结构参数对细胞膜应变的影响，即两相之间的界面面积。结果表明IES参数和流速对细胞膜应变有较大的影响。仿生IES结构比圆形孔具有跟多的优点，因为狭缝结构比圆形孔具有更低的流动阻力。设计并制作了一种基于仿生IES的超薄（500nm厚）氮化硅过滤器微流控装置，用于高活性ctc的高通量富集。氮化硅过滤器面积高达36mmsup2;（6x6mm），包扩近18000个狭缝单元，这有利于高通量设备。此外，研究了速度，缝宽，稀释比和溶液体积等参数对细胞捕获效率和细胞活力的影响。结果表明基于仿生IES的微流体装置在保存活细胞方面具有很高的潜力。本研究定量探讨了CTC物理过滤过程中不同参数对细胞活力的影响。此外，本研究将有助于设计捕获高活力细胞的高通量CTC浓缩设备。
关键词ctc脾内皮间缝活力高通量分选
1介绍
癌症是一种高死亡率的疾病，死亡率不断上升引起荷兰国际集团的注意。癌症的一大危险是癌细胞能从原来的器官传到其他器官。血液或淋巴系统的一个过程称为癌症转移。癌细胞从原发性肿瘤细胞和循环外周血称为循环肿瘤细胞(CTCs)其中包含许多关于患者的基因和病理有助于诊断和治疗。这些发现表明CTCs可以作为医学诊断中的癌症生物标记物鼻等领域。然而，ctc非常罕见，每毫升只有几百个ctc。 在进行CTC病理分析之前，必须从全血中富集CTC。此外，分离活的ctc的困难限制了进一步的分析，例如基因和药物试验。随着技术的进步，CTC富集方法得到了迅速的发展。生物方法通过特异性抗体-抗原相互作用捕捉靶细胞，包括上皮细胞粘附分子（EpCAM）和其它生化分子。迄今为止，fda唯一批准的CTC分离物系统是CellSearch@系统，哪一种是具体代表性的生化方法。CellSearch@系统捕获目标单元格通过免疫磁表达EpCAM分子珠子。然而，在转移过程中，肿瘤细胞会发生上皮细胞向间质细胞转化（EMT)不表达EpCAM等重要标记物。不幸的是，这个问题是一个基本限制生物化学的方法是不可避免的。此外，维持免疫组化所捕获的ctc的活力由于不可抗体抗原，磁珠是困难的绑定。许多富集方法的区别在于ctc和正常血细胞之间的物理特性，如细胞密度,尺寸和变形能力和介电常数发展并取得了可观的收获。这些物理富集方法有两种与生化方法相比有明显的优势。第一个优点是大多数物理分离方法不需要标签，这对后续非常重要需要活细胞和未受干扰的细胞的分析。美国证交会另一个优点是物理方法需要更少的时间因为癌细胞不需要生化方法标记。受益于高吞吐量和成熟技术上，微滤法是一种应用广泛的物理富集法。微型滤波器与不同的材料和不同的结构参数开发来捕捉CTC，并取得了令人满意的成绩的成功。一种市面上可以买到的过滤器有两个很大的缺点：低孔隙度（3-5%），分布不均匀、随机限制吞吐量和捕获性能的孔隙浓缩装置。克服上述缺点，光刻制造介绍了一种制备均匀图案微粉的方法不同材料制成的过滤器，如对二甲苯、PEGDA、SU-8、PDMS，硅，硅氮化物和镍，用于CTC富集。然而。微滤光片的研究大多集中在提高捕获性能上CTC浓缩装置的速度、纯度和处理量。在提出了一种基于尺寸的方法低成本和可移植性被广泛应用于CTC类荷兰国际集团。然而，尽管循环的平均直径肿瘤细胞比白细胞大，还有直径重叠的问题，这就导致了循环肿瘤细胞分选效率低。此外，研究人员综合了变形能力的差异在循环肿瘤细胞和白细胞之间进一步开发一种基于尺寸和变形能力的排序方法。但是，这种方法可能仍然存在着失败的问题ctc。尽管细胞活力对于随后的分析中，很少有关于微过滤器的研究关于提高细胞活力。影响细胞的主要因素在物理富集过程中的活力是细胞的膜ctc膜破裂。郑和他的同事仿造了3D微滤波器和柔性微弹簧阵列器件降低细胞膜的变形能力，捕获活菌ctc。然而，作者只考虑了静态压力对CTC生存能力的影响。此外，参数滤波器的结构还有待优化。与静态模拟的流量压力相比域，动态模型可以提供更多的信息更好的分析。因为细胞之间的相互作用微流体器件是在细胞水平上考虑的内部细胞结构的影响，如胞壳伊顿，可以忽略。通常，单元格被建模为连续材料，可分为两类∶一个固体模型和一个液体模型。和固体相比模型中，液体模型具有变形大的优点。Zhang等人开发了一种液体模型进行探索三维约束几何对压力的影响通过通道的CTCs。然而，动态膜在细胞的分离过程中，尚未探讨。脾脏，大约10-12厘米长，重200g位于左上腹部。它是最大的免疫器官在人体中起着重要的作用在免疫系统中的作用。与此同时，脾也是一个可以去除老化和患病红细胞的过滤器来自循环系统。当红细胞的形状、大小或变形能力发生变化。脾脏会阻止这些红细胞通过。物理滤波功能脾脏是由显微镜下的间质决定的脾窦的结构，它是最窄的圆环血管系统的潜在瓶颈。脾窦的特征是高纵横比内皮间裂隙（IES），厚度仅为亚微米（0.2-0.8微米）和微米大小的长度和高度（3-5微米）微米。受到脾窦过滤红细胞功能的启发，我们研究了一种用于捕获循环肿瘤细胞的仿生脾窦微流控芯片。我们开发了一个动态多相流模型来探索影响不同的血流和脾脏的参数细胞膜上的内皮缝隙（IES）结构膜压力。仿真结果表明圆孔结构，内皮缝（IES）结构在孔隙率、吞吐量和细胞的生存能力有一定的优势。此外，我们设计并制作了用于CTC分离仿生脾窦微流控制装置，用于超薄氮化硅制备狭缝滤光片。氮化硅有良好的性能，如它的高结构，强度高，透明度好，生物相容性好。导致该装置有较强的富集性，高效、高通量、高细胞活力。这项工作是否有潜力解决CTC生存的关键问题是分离密度。
2材料与方法
2.1细胞膜破裂的定义
在物理分离过程中，细胞会经历来自流体的相互作用的压力在细胞和过滤器之间，就会形成细胞膜的变形。全动态CTC分离过程可分为两种过程。第一种过程开始当细胞开始与过滤器互动并继续直到这些细胞被完全捕获并继续，直到结束了整个分离过程；细胞经历静态压力在第二个过程中。细胞膜在第二个过程中变形比第一个过程中要大。此前，微量吸液管实验表明细胞会破裂细胞膜的活性超过6%。因此，以6%的细胞膜菌种为临界较高的数值可是为细胞破裂仿真。
2.2仿真描述与设置
应用流体体积（VOF）模型对其进行了研究通过IES滤波器或圆的单元变形孔隙过滤器（图1）。VOF模型跟踪不溶性物质界面由两相组成，可以描述细胞膜。初生体积分数相（a）在0和1之间变化。为提高数值精度，采用可实现k-e模型;在该模型中，引入了湍流动能k和其耗散速率e。此外，采用了适用于瞬态计算的PISO （Pressure-Implicit with Splitting算子）格式对于压力速度耦合。此外，还应用了压力惊人选项（PRESTO）方法地质重建方法的应用体积分数空间离散化。这两种方法是可以相通的。对于边界的设置，入口为通道设置为具有恒定的流量，以及出口设置为压力出口。周期边界条件应用于流体体的侧面，而无滑移在槽壁处施加固定条件。因为在侧面有周期性的边界条件流体边界处，滤波膜被认为是无限的我们的模拟。根据人体的血液性质，可以把流体密度设置为1025kg/m，动态粘度是3times;10-3Paos。电池与电池之间的接触角模型中的角度是180°，这意味着细胞不是粘附在过滤壁上。表面的典型值白细胞（WBCs）的张力为30times;10°N/m，为方便起见，我们的模型中使用了一千多文献。由于个体样本的巨大差异，ctc机制不同的研究报告的特性有很大的不同接近于wbc的值对应的值比wbc的硬度高近10倍。我们模拟了不同IES参数的影响，如滤膜的几何形状、滤膜的厚度和滤膜表面张力，对细胞膜张力的影响。在这里，我们比较两种过滤器几何形状∶IES和圆形孔。对于一个微滤膜的研究于应用将微滤膜的孔隙率和特征尺寸固定在一定值。圆孔的直径和狭缝的宽度孔隙的设置为7微米。
图一仿生脾脏微流体装置示意图用于CTC排序的IES。（A）IES结构仿真模型。(B)圆形孔隙模拟模型。（C）CTC示意图采用仿生IES微润装置物理过滤法。（D）脾窦结构示意图
2.3仿生脾的设计与制作窦微流控CTC分离装置
设计了仿生脾窦微流控装置一种三明治结构，由三部分组成∶顶层底层为聚二甲基硅氧烷室，滤池膜位于这些层之间。聚二甲基硅氧烷腔室包含一个微流体通道连接到过滤膜，顶部腔室是CTC捕获底室为废液室。顶部和底部腔室是用标准软光刻制作的。一个10毫米X10 毫米的正方形硅片
一个400 um厚的SU-8图案被用作模具。一个聚二甲基硅氧烷预聚物混合物（固化剂与聚二甲基硅氧烷的比例）1∶10，被倒在模具上在真空室脱气30分钟。固化后在70℃的热板上加热2小时，聚二甲基硅氧烷从并为下一步模具制作做好准备。然后，捏造用氧气等离子体固化聚二甲基硅氧烷腔体结合过滤膜。
受脾窦结构的启发，我们介绍IES作为过滤单元。狭缝滤波器的宽度，哪个是临界尺寸，从5到8 um，和设计了长度为100 um的狭缝滤波器。因为氮化硅薄膜是透明、稳定和无荧光的最后，得到了单层氮化硅图案结构作为过滤膜设计。此外，硅氮化膜具有高的拉伸强度，这允许高孔隙度大，过滤面积大，避免复杂安装程序或额外的支持结构。膜面积为6 mm times;6mm，膜厚度为500微米。大而硬的细胞将被捕获在顶部膜。过滤膜的制备微细加工工艺如图2所示。首先，一个硅在表面沉积了具有一定拉伸应力的氮化膜等离子体增强化学的气相沉积法在厚度为400 um的硅衬底上进行了扫描。氮化硅薄膜（500 nm）厚度由沉积时间控制，应力大小由沉积参数控制。第二，不同研究报告的2微米的性质差异很大，采用等离子体增强化学气相沉积法技术在涂层上沉积了较厚的硅氧化物层硅衬底的背面作为耐腐蚀的材料层。然后，得到高分辨率的正极光刻胶AZ6112 被旋涂在氮化硅薄膜上。紫外线用对准器（sussma6）曝光光刻胶层，它被具有特定阵列图案的铬掩膜覆盖。AZ-MIF 400溶液用于光刻胶显影，用去离子水进行开发后清洗晶圆。然后，晶圆用热板在120℃的温度下烘烤2分钟阵列图案从光刻胶层转移到反应离子刻蚀。硅氧化物层的背面也通过光刻和反应离子刻蚀形成蚀刻窗蚀刻。光刻胶厚度为10 um AR-P3210并在ar300-26溶液中开发。需要注意的是，不需要对AR-P3210进行后处理因为高温会使图案变形。由反应离子刻蚀产生了有图案的硅氧化物层由与AR-p3210一起为硅蚀刻提供了电阻。然后，采用电感耦合等离子体蚀刻采用（ICP蚀刻法）刻蚀大部分大块硅（厚度380 mu;m）。残余的块状硅（20 mu;m）用KOH溶液腐蚀。
图2仿生IES微流控器件的制备过程。（A）氧化硅硝化膜的制备工艺。（B）聚二甲基硅氧烷爬坡机的制作工艺
2.4细胞培养
选择MDA-MB-231细胞进行富集试验。在中国科学院细胞库在DMEM（一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基）中培养，并辅以1%链霉素/青霉素和10%胎牛血清，并在37℃，5% CO2下孵育35毫米盘（美国赛默费雪科学公司）。细胞胰蛋白酶- 乙二胺四乙酸溶液孵育1min形成细胞悬浮液，于每分钟1000转，5分钟收割。然后将细胞浸泡在新鲜的DMEM中并吸出通过轻柔的移液再次形成细胞悬浮液。之前每次实验，细胞胰蛋白酶化并重悬在磷酸缓冲言溶液或健康的人外周血中这些细胞被用标准计数法手工计数统计至少重复了三次操作错误。
2.5癌细胞激增
细胞浓度首先通过人工计数确定用血球计对细胞进行连续检测用Dulbecco公司的磷酸盐缓冲盐水稀释（DPBS;PAA Laboratories GmbH）的近似浓度每孔100个细胞。随后，实际数量
悬浮液中的细胞是通过等分格单元引用来确定的细胞悬液（100 微升）置于96孔板中，并手动在显微镜下计数细胞。细胞计数至少重复三次，并取平均值减少操作错误的影响。细胞悬液体积为100个细胞加入1毫升稀释的健康人全血中，用不同体积（0-2毫升）的磷酸缓冲盐溶液洗涤缓冲液（DPBS2mM乙二胺四乙酸（EDTA）；和0.5%牛血清蛋白（BSA））。
2.6细胞活力的表征方式
大约100个MDA-MB-231乳腺癌细胞加入lml的DPBS溶液中，通过过滤器。然后，用lml纯DPBS溶液所述过滤装置以冲洗通道和过滤器。在上述过程后，活、死测定用于细胞干燥。将活细胞用Calcein-AM染成绿色，显示绿色发射，死细胞用乙锭同源二聚体-1染色体，在荧光显微镜下显示红色发射。
2.7人体血液样本
健康人体血液样本（抗凝用乙二胺四乙酸）由安徽省同意的捐赠者提供省级医院的标准程序，然后，整个血液样本保存在含有乙二胺四乙酸的采集管中防止凝血。随后血液样本保存在-4°的冰箱中。所有血样均在24小时内用于实验。部分血液用PBS洗涤缓冲液多次稀释样品。测定血药浓度的影响对分离效果的影响。血液样本和PBS的比值解决方案是1:0，1：1,1:2，1:5和1:10。
剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料
资料编号：[590100]，资料为PDF文档或Word文档，PDF文档可免费转换为Word
以上是毕业论文外文翻译，课题毕业论文、任务书、文献综述、开题报告、程序设计、图纸设计等资料可联系客服协助查找。
