由铱(III)配合物组成的高效率电化学发光标记物外文翻译资料

 2023-05-16 15:28:11

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由铱(III)配合物组成的高效率电化学发光标记物

摘要：提高标记剂的性能对进一步发展电化学发光(ECL)相关技术至关重要。虽然目前已经报道了大量基于钌配合物的ECL发光体，但关于新型ECL标记物的研究仍然很少。本文合理设计了5个新的铱ECL标记物和一个由钌配合物组成的对照标记物，并利用光物理技术、理论计算和电化学表征以评估其ECL性能。无论是在共反应物辅助电位扫描实验中，还是通过湮灭方法，在相同的条件下，这些大多数新铱标记物中的都表现出与三-2,2 -联吡啶钌(II)[简写为Ru(bpy)32 ]相当或者更强的ECL信号。最重要的是，使用相同的标记方法，在ProCell缓冲溶液中，用铱标记的牛血清白蛋白(BSA)比用传统钌络合物标记的相同量(本研究中以钌为基础的标记)显示出更强的ECL信号(1.9倍)。除了具有显示各种发射颜色的优势外，本文报道的新型铱标记物可能为基于电化学发光的分析技术的进一步发展提供见解。

引言

电化学发光(electrochemilescence, ECL)的定义是电极通过电化学反应生成激发态物质而产生光的发射。这种现象最初是在20世纪60年代的有机小分子中发现的。随后，在20世纪70年代初，Bard等人揭示了过渡金属配合物三-2,2′-联吡啶钌(II)[缩写为Ru(bpy)32 ]中ECL的详细机制。ECL由于具有灵敏度高、不受激发光噪声信号影响的优点，目前已发展成为一种广泛应用的分析技术。Ru(bpy)32 及其类似物作为一种已被广泛研究的金属配合物，在近几十年的ECL相关科学研究和技术发展中发挥了重要作用。然而，随着分析技术的发展，Ru(bpy)32 的缺点逐渐显现，如量子效率低。开发新型ECL已成为该领域研究的重要课题之一。

到目前为止，许多其他金属配合物，比如铕、铼、铜、锇、铝、铽、铂和铱都被设计成ECL发光体。在这些非钌系中，铱配合物具有更高的量子效率和可调的发射颜色(从蓝色至近红外光)，似乎是Ru(bpy)32 及其类似物最有效的替代品。例如，Kim等人在2005年首次在铱ECL染料方面取得了重大突破，我们的团队通过取代基修饰进一步开发了几种更具发射性的ECL染料。除了这些ECL染料，许多其他团队也在开发ECL发光体方面进行了出色的研究，比如Ding、保鲁西、霍根、弗朗西斯和其他人。

作为一项重要且非常成功的分析技术，ECL在临床诊断市场显示出巨大的商业价值，迫切需要ECL标记剂，因为它们在这些分析应用中起着至关重要的作用。然而，除了由Bandini等人设计一些甲酰基(-CHO)功能化的铱ECL发光体以及Zhao等人最近报道的铱ECL标记，不幸的是，由于缺乏生物偶联基团，使用已报道的ECL染料来标记生物分子非常困难。为了进一步促进在ECL技术下游的发展的应用中，开发优秀的新颖ECL标记物不仅是迫切的，而且是进一步发展基于ECL的分析技术的必要条件。

羧基功能化ECL标记是开发标记生物分子的光团的重要方法之一。基于我们之前对电荷中性铱(III) ECL光团的研究，在此，我们制备了五个新的阳离子铱标记物和一个对照钌标记物，每个都含有一个羧基。这些标记物已经通过研究它们的ECL性能进行了全面的评估，包括发光标记物和在标记BSA的真实条件下。如图1所示，需要注意的是标记基团-COOH在这些ECL标记物的脂肪链上，而不是在芳香族基团上，这不仅可以增加这些标记物的溶解度，而且还可以确保它们在下游应用中对生物分子的反应性更强，因为空间效应更小。总之，这项工作的主要目的是开发几个优秀的新颖的ECL标记物下游ECL技术的应用。

结果与讨论

分子设计与合成

除了引言中提到的制备一个带有羧基的辅助配体外，选择一个主配体设计铱ECL标记物也是合理的。我们知道，主配体的化学结构与对应配合物的发光性质密切相关。在我们之前的研究中，dfppy、dmpq已经被确定为设计高效ECL光团的主要配体的合适候选。因此，这些配体是我们分别设计铱ECL标记物2、3和4的首选配体。此外，ECL标记物的各种发射颜色在分析应用中也很有重要。因此，本研究也分别选用2-苯基吡啶(ppy)和6-(苯并噻吩- 2-基)非蒽丙啶(btphen)作为ECL标记物1和5的设计材料。总之，分子设计的目标是探究各种发射颜色的高效ECL标记物。

合成路线和相应的表征数据分别如图1和实验部分所示。与商业上可购买的顺-双-(2,2′-联吡啶)二氯铀(II)二水合物(顺- ru(bpy)2Cl2·2H2O))一步合成的钌基标记物的比较，在这项工作中，铱标记物的合成涉及两个主要步骤。第一步主要是合成含有相应双齿配体C^N的二氯桥联铱(III)二聚体。中间体在24小时后从反应溶液中析出。由于它们在普通有机溶剂中的溶解度差，无法用硅胶柱层析法进行纯化。因此，中间体二氯桥联二聚体在用水、乙醇和正己烷依次洗涤几次后，无需进一步纯化即可用于下一步。在下一步开始时，反应溶液是浑浊的。在N^N配体取代二氯桥联铱(III)二聚体的过程中，溶液逐渐澄清，用TLC观察到一种新的发光产物。12小时后，反应完全结束，使用硅胶柱层析法对铱配合物进行纯化，采用核磁共振、红外和飞行时间质谱(TOF MS)对其进行了表征。

吸收、光致发光

由于其广泛的电化学窗口，乙腈通常被认为是电化学和ECL研究的理想溶剂。为了保持一致性，在乙腈中也对标记物的光物理性质进行了表征。图2A为这些标记物在乙腈中的室温吸收光谱。显然，由于所使用的主要配体不同，这些铱标记物显示出不同的电子跃迁特征和吸收强度。一般来说，350 nm以下的区域属于以C^N为主配体和N^N辅助配体为中心的内配体pi; - pi;*跃迁。由于这些标记物中铱原子的强自旋轨道耦合效应，350 nm处的能带是自旋允许的单重态到单重态金属与配体电荷转移的混合物(1MLCT)以及自旋禁止的单线态到三重态金属-配体电荷转移(3MLCT)。有趣的是，3、4和5标记具有更大的pi;共轭度和电子给予基(-CH3)或原子(S)的吸光度略高于标记物1和2。对于在这项研究中控制基于钌的标记物, MLCT波段(400-500 nm)的强度也比母配合物Ru(bpy) 32 略有提高。这也可以归因于加入取代基(丁酸和甲基)对联吡啶配体的给电子效应。

图2B为这些标记物在乙腈溶液中在室温下的光致发光(PL)光谱。正如预期的那样，由于主配体的不同，这些标记物显示出不同的发射颜色。标记2的发射波长最短，这是由于两个氟原子对dppy配体有很强的电子拉离作用，而pi;共轭度最大的苯配体诱导标记5的变色移至707 nm，具有近红外(NIR)发射。根据图2B，这些ECL标记物的发射颜色从绿色到橙色到红色到近红外。有趣的是，在标记物4中也观察到肩峰现象，这通常是含有bt配体的铱(III)配合物的共同特征。与Ru(bpy) 32 相比，钌基标记物的发光光谱出现了35 nm的深色位移。此外，使用fac-ir(ppy)3 作为参考，我们也计算了这些ECL标记物的PL量子效率，列于表1。光物理数据表明，这些铱ECL标记是优良的光团，进一步的ECL研究是非常值得期待的。

理论计算

为了进一步研究这些新型铱标记物的光物理性质，利用密度泛函理论(DFT)和随时间变化的密度泛函理论(TD-DFT)，利用高斯09程序，采用量子化学计算方法研究它们的前沿轨道和激发态。为了简化这些标记物的化学结构，在几何结构中省略了氯离子计数器优化。在查阅了有关过渡金属配合物理论计算的文献后，金属原子最终采用LANL2DZ基集，碳、氮、氢、氧、硫等其他原子采用6-31G基集。

首先，利用DFT计算优化这些标记物的基态。从图3可以看出，最高占据分子轨道(HOMO)主要分布在主配体的铱中心和碳配位部分的混合物上，最低未占据分子轨道(LUMO)主要分布在N^N配体上。此外，标记物2上的两个氟原子使它的HOMO能级最低。因此，标记物2的HOMO和LUMO之间的能隙最大(Delta;E)，也是这些铱标记物中发射波长最短的。此外，从理论计算得到的Delta;E值的序列为2 gt; 4 gt; 1 gt; 3 gt; 5，与PL光谱一致，表明本文工作中使用的计算方法是相当可靠的。

在基态几何优化的基础上，利用TD-DFT计算进一步研究了这些标记物的激发态，结果如表2所示。除标记物5的三重态外，本工作中其他标记物的激发态主要归属于从HOMO到LUMO的跃迁。根据前线轨道上的电子分布，我们可以合理地得出结论，这些铱标记物的发射性质是由金属-配体电荷转移(MLCT)和配体(C^N)-配体(N^N)电荷转移(LLCT)的混合物引起的。然而，标记物5的三重态的性质有点复杂。从ESI图S1可以看出，HOMOminus;1的电子分布主要位于主配体的碳配位部分，而LUMO 1和LUMO 2分布在整个主配体上。因此，标记物5的释放可以归因于MLCT和配体内(C^N)电荷转移(ILCT)。

从表1和表2中可以看出，值得注意的是，三重态的计算波长几乎与这些铱标记物的PL光谱中观察到的波长相同，表明TD-DFT计算是预测铱配合物发射波长的有效方法，为新型光团的设计提供了有用的信息。需要注意的是，基于钌的标记物的理论计算结果也列在ESI中(表S5、S7和图S2)。

电化学和电化学发光(ECL)

由于氧化还原性质在ECL研究中的重要性，电化学表征首先采用循环伏安法(CV)。ESI的CV曲线如图S3所示，数值数据列于表3。因此，由于主要配体的不同，这些铱标记显示出不同的氧化还原性质。具有两个甲基且pi;偶联度较大的标记物3的氧化电位比标记物1低得多。在标记物4和标记物5的比较中也发现了同样的现象。此外，电子退出组-F诱导标记物2的氧化电位发生正转移。

基于这些标记物在乙腈溶液中的氧化还原性质，我们认为一种“氧化-还原”共反应物有助于这些新标记物中ECL的生成。考虑到三丙胺(TPA)在商业ECL体系中的成功和广泛应用，最后进行了以TPA为共反应物的这些新型标记物的ECL研究。在含有0.1 mM ECL标记物、10 mM TPA共反应物和0.1 M四丁基六氟磷酸铵(TBAPF)的乙腈溶液中，ECL信号随电位的CV曲线和ECL信号随电位的变化如图4所示)支持电解质。为了进行对比，同样实验条件下基于钌的标记物的结果如图4所示。在图4中，ECL标记物的氧化峰完全被TPA的氧化峰所掩盖，因为TPA的浓度远高于ECL标记物的浓度。在TPA和相应的标记物复合物氧化过程中，可以观察到ECL信号，其强度达到最大值，超过了相应标记物的氧化电位峰值。

由于共反应物辅助ECL的复杂化学和电化学过程，很难建立一种可靠的方法通过电位扫描实验计算ECL效率。为了评价TPA辅助的效果，在相同的实验条件下，这些标记物的综合ECL强度归一化为Ru(bpy)32 的ECL强度。从表3可以看出，与Ru(bpy) 32 相比，所有这些新的ECL标记物表现出同等甚至更强的ECL强度。必须指出，通过共反应物的优化，这些新型ECL标记物的ECL性能还有很大的提高空间，因为TPA仅被认为是Ru(bpy) 32 的最佳共反应物。

为了计算绝对ECL量子效率，这些标记物的ECL信号通过湮灭途径进一步产生。根据前几份报告所充分证明的概念，这些新标记物的绝对ECL效率也被计算出来，并列为Phi;ECL 在表3中。应该指出的是Phi;ECL 标记物3的含量高达0.859，是Ru(bpy)32 的近18倍。此外，除标记物2外，所有其他铱标记物的ECL绝对效率均与对照钌基标记物相当或更高。值得一提的是，ECL信号的强度也与生成途径有关，这在之前的报道中也有观察到。总的来说，具有较低氧化电位和较高HOMO能级的标记物3和5显示出更多强烈的ECL信号，无论是TPA辅助途径还是湮灭途径。但必须强调的是，ECL是一系列复杂的化学和电化学过程。因此，电极材料、共反应物、发光体的氧化还原特性、溶剂体系、施加在电极上的电压，甚至是光电探测器的类型都会影响获得的ECL信号的强度。这项工作和我们之前对电荷中性铱(III) ECL染料的研究的实验结果表明dmpq配体是设计高效ECL光团的最合适的配体之一。

此外，在TPA的帮助下也记录了ECL光谱，如图5所示。因此，这些标记物的最大ECL波长也列在表3中。正如预期的那样，由于主要配体的不同，这些新型标记物显示的ECL波长范围从508 nm到702 nm。最大ECL波长与相应的PL光谱几乎相同，它们的微小差异可能归因于其他物种(如TPA和TBAPF)的存在和不同的发射狭缝宽度用于ECL和PL表征。此外，与大多数钌配合物的红色发射色不同，这些新颖的铱ECL标记物在其各种发射色(从绿色到近红外)方面表现出优越的性能，这可能对其下游分析技术的应用非常重要。

标记BSA和相应的ECL表征

生物标记通常是生物分子检测的重要步骤，而生物分子信号的扩增与标记剂的性能密切相关。在乙腈溶液中优异的ECL性能的标记鼓励我们进一步研究它们在真

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