用于细胞保护的“自修复”纳米壳外文翻译资料

 2022-07-29 16:50:05

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用于细胞保护的“自修复”纳米壳

自修复是生物体自我保护的一种本能方法，然而大部分单细胞生物天生的就缺少这种自我修复的能力，这极大程度的限制他们的应用。在这里，我们提出一种自组装方法，使用纳米多孔聚合物在细胞表面创造一个纳米壳，这种壳体可以帮助细胞进行自修复，从而导致细胞在恶劣环境下（如紫外灯辐射，有毒物质入侵，高光辐射以及Ph值的改变等）有高活性并增加细胞的存活率（真核细胞与原核细胞）。此外，提出和研究了相互作用机制，这种机制成功的指导了使用不同生物活性分子的自修复生物混合壳体的设计与合成。

介绍

自修复是一种在长时间的进化中形成的生物体很常见并且很好的一种使细胞适应不断变化的环境的现象。然而这种自修复在单细胞生物中很少见，这可能是多细胞生物比单细胞生物具有更好的适应环境的能力和自我修复能力的原因。因此赋予单细胞这种自我修复能力是很有意义的。一个不需要复杂的遗传操作就有壳体的细胞结构被认为是目前最有效的非生物成因的用细胞保护和功能化的方式。这种物理化学性能可调的纳米结构壳体为细胞提供了不可缺少的平台来赋予细胞新的功能，例如掺杂Fe3O4的细胞壁细胞会有磁性，掺杂SiO2的细胞壁细胞会有耐热性，掺杂Au/Ga/石墨烯的细胞壁细胞会有导电性，掺杂LnPO4的细胞壁细胞具有抵抗紫外光的能力，掺杂poly(甲基丙烯酸）-co-NH2的细胞壁细胞具有对Ph响应的能力。然而传统的纳米壳结构不能满足日益增长的现代应用需求，因为这些合成的细胞壁不仅扰乱了细胞增殖和寿命周期还不能在封装后在细胞表面重新组装。一旦这种壳结构破碎往往会导致细胞分裂，这就会降低细胞的稳定性并使组装功能损失，子细胞也会产生。纳米尺度的细胞壁来进行自我修复是首选的，通过它功能性前驱体可以在细胞分裂时自己组装到细胞表面。

天然的氨基酸可以凭借它们的生物活性组织以非共价键的方式在细胞表面（例如，氨基，羧基和硫醇基等）。因此它们可以不断地自己组装在细胞表面从而形成纳米级分子层。像基础的生物分子一样它不需要复杂的合成过程，氨基酸具有和小生物分子相似的物理化学性能，因此它是做纳米细胞壳体很好的选择。然而单独的氨基酸会穿过细胞膜与细胞壁进行传输，所以氨基酸分子不能作为壳体材料稳定的呆在细胞表面。金属纳米粒子已经成功的引入壳体材料，然而氨基酸和这种金属纳米粒子可以相互作用。在这篇论文中，Au纳米分子和L-半胱氨酸分子的聚合物已经成功的应用在纳米壳体于细胞表面从而使细胞具有自我修复性能。这种自组装纳米级壳体由于性能和Au纳米粒子的影响表现为蠕虫状多孔结构。有趣的是，这种壳体不仅允许物质快速的进行交换还可以增加细胞在复杂环境中的活性和稳定性，还可以增加适用性，例如它可以保护细胞抵抗强紫外线辐射、有毒物质、强光辐射和Ph值的突然改变等。最重要的是这种自组装Au纳米分子和L-半胱氨酸分子的聚合物可以像在溶胶前驱体一样在培养基中分散从而修复破损的壳体来形成完整的壳体。

这种生物杂交聚合物是第一次被研究。L-半胱氨酸在室温下添加到金胶体中（从TEM显微照片Fig.1a中可以观察到2-3纳米直径）。沉淀物在经过离心，清洗筛选出来。从TEM显微照片可以观察到这种生物杂交聚合物具有4-8纳米尺寸的纳米多孔结构（Fig.1b）。从FTIR和XPS光谱中可以观察到明显的Au-S键（Fig.1a和b），表明了这种生物杂交产物反应与结构是稳定的。从紫外可见光谱的结果中可以看出这种聚合物不仅可以吸收高强度的光（Fig.1c），还可以在溶液中稳定存在（Fig.1d）。可以确定的是这种生物杂交聚合物在溶液中可以稳定存在并且具有纳米多孔结构。这些性能不仅可以使壳可以自己聚合和自修复，还可以促进物质通讯。

啤酒酵母细胞被我们选来作为真核细胞的代表来研究自修复行为。我们首先将这种生物杂交聚合物分散在PBS中，之后我们将聚合物在室温和温柔的摇晃条件下加入到洁净的细胞环境中（Fig.1）。在酵母细胞和预成型的前驱体反应期间（Fig.1c），酵母细胞逐渐的被Au纳米分子和L-半胱氨酸分子的聚合物凝结的壳体包埋（Fig.1d），被包埋的细胞和多余的聚合物聚集在一起重新分散在新鲜的媒介中为了更深一步的研究。从TEM、OM、和TEM显微图片（Fig.1）上可以清楚的观察到酵母细胞单独的被包埋在紧密的壳体中并保留着他们原来的形貌，这表明这种自聚合对生物细胞形态没有消极的影响，这种生物杂交聚合物在细胞表面形成2-6纳米尺寸的蠕虫纳米多孔结构（Fig.1b），这个尺寸比TEM中预成型前驱体尺寸略小（Fig.1b）。这种细胞表面和聚合物都相互作用可能会导致纳米通道微小的形变。从TEM纤维图片（Fig.1c）中可以观察到细胞被相同的160纳米厚度的壳体包埋，并且细胞形态始终保持完整。在EDX中可以观察到这种含有Au元素的聚合物一致的包覆在细胞表面（Fig.1d）。细胞培养表明这种封装细胞的生长曲线和天然的细胞相似，这表明这种壳体对细胞分裂没有明显的影响。最后可以得出结论：（1）我们的实验和传统的分层技术方法相比是简单容易的，不需要大量的细胞周期多层沉积，这意味着细胞在封装后还可以保持生命活性；（2）当细胞破裂，这种细胞相容的生物合成聚合物可以有效地覆盖在细胞表面实现自我修复；（3）这种纳米多孔结构的壳体可以有效的促进物质、能量运输和细胞分裂。

Fig.1

结果与讨论

为了测试在恶劣的条件下生物合成的壳体能否保护细胞的增殖，我们将封装的酵母细胞和原始的酵母细胞的相对活性进行了对比。结果表明细胞在新鲜的介质中可以保持其生命活性。因此，封装的酵母细胞培养在纯净的液体培养基中和短波紫外辐射下（UVC是太阳光中最强的紫外线可以破坏细胞的组织结构）(Fig.2)。封装的酵母细胞在UVC辐射下保持更高的生命活性。例如，在辐射了5个小时后，98％(plusmn;6%)的封装酵母细胞保持着其原始的活性(Fig.2a)，然而原始的酵母细胞在5小时之内很快的失去了其活性(Fig.2c)。在没有培养基的正常条件下，封装的酵母细胞比原始的酵母细胞(Fig.2d)也表现出较高的活性。这种较低的活性应该归因于细胞的分裂能力的缺失。此外，纳米尺寸的天然毒素（溶壁酶）35入侵实验表明这种壳体可以保护细胞抵抗自然毒素的入侵。

Fig.2

有必要指出的是，当壳体很薄和软时封装的酵母细胞可以轻松地打破壳体并进行细胞分裂，这看上去会导致细胞功能的丢失和稳定性的下降，然而，封装的酵母细胞仍然具有较高的细胞增殖活性。因此，应该存在着其他的保护机制。酵母细胞增殖的表面和形态的SEM显微图片为Fig.3(a-e)和Fig.S7A。显微图片显示酵母细胞是通过典型的出芽繁殖产生子细胞的，并且在繁殖时细胞形态很正常，没有出现褶皱的情况。值得注意的是，细胞表面的纳米粒子在生命周期的5个阶段中没有显著的减少（G0,S,G2,M和G1阶段见Fig.3和Fig.S7A）。分裂细胞的壳壁厚度（大约140nm，Fig.3f）和单一的细胞相比变得略薄，这是因为细胞分裂是表面积会增大。用原始的生物合成的壳体来同时包埋母细胞和子细胞是不可能的，尽管这些壳体变得柔软并且可以变形。多余的生物合成的聚合物便在自组装到裸露的子细胞中发挥着重要的作用，因为唯一的可能性就是溶液中多余的聚合物自修复变薄和破损的壳体。

在Fig.3f和Fig.S7B标记的方形和圆形区域中可以看到自修复直接的证据，母细胞和子细胞的细胞壁厚度没有差别（Fig.S7B(b)圆圈区域），这表明生物合成的聚合物可以自组装到裸露的母细胞和子细胞表面。更有趣的是，在母细胞和子细胞新产生的界面处发现了这种聚合物（Fig.S7B(a)方形区域）。这表明，这种生成的界面在细胞分裂后被原来的生物合成聚合物壳体或多余的纳米聚合物填充。很独特的是破裂的壳体可以通过生物合成的聚合物的自组装实现自我修复，这表明，在生命周期中生物合成的壳体可以保护细胞并可以使细胞功能化。相比之下自组装现象在聚合物和无机物这种存在多余的壳体材料环境中的酵母细胞中很难发现。这表明传统的聚合物和无机壳体甚至在存在多余的壳体材料时也没有自我修复功能，直接导致在细胞封装时传统的较大的聚合物前驱体很容易聚合。这种行为在Fig.S9a和b中可以证实。从TEM图像中可以看出Au@PAH和Au@PLL（Fig。S9b）纳米聚合物可以轻松的聚合成为很大的聚合物颗粒或者大规模网状聚合物。这些大的聚合物和析出物很难在细胞表面进行自组装或在自我修复破损的细胞，相比之下，基于纳米聚合物的氨基酸分子基于其纳米反应和其表面官能团可以轻松地实现自我修复的功能，这是氨基酸分子在壳体中以实现自修复的一大优势。

Fig.3

这种自修复现象不仅限于真核细胞中，原核细胞一样存在。在全球碳循环中骑着重要作用的蓝藻细菌被选作原核细胞的代表，在SEM和TEM图像中可以看到封装的蓝藻细菌的自修复过程（Fig.4A和B）。Fig.4A表明，蓝藻细菌的繁殖是典型的二分裂，并且在分裂时细胞表面形态正常没有褶皱，这意味着这种壳体对封装的细胞分裂没有限制。可以清楚地观察到在整个分裂周期中纳米粒子聚集在细胞表面。和酵母细胞相比封装的蓝藻细胞的壳厚度较薄（大约100nm.Fig.4B），这表明，和酵母细胞相比蓝藻细胞和生物合成的聚合物之间的相互作用较弱，这因为细胞表面的生物和物理化学性能的不同。此外，这种自修复的生物合成的壳体可以保护细胞免受恶劣环境的影响，例如强光、强紫外线辐射和Ph的突然变化（Fig.S10）。

Fig.4

对短波紫外线辐射、强光辐射、自然毒素入侵和突然的Ph值变化的抵抗都归因于这种生物合成的壳体，例如对短波紫外线和强光（波长为190-280nm、450-700nm（Fig.S2d））的强吸收，氨基酸与毒素之间的强相互作用（Table S1）以及氨基酸分子良好的缓冲能力。值得注意的是，增殖过程中的细胞保护是由于包埋细胞的自我修复能力，纳米聚合物在细胞表面的自组装是自修复的主要因素，可以合理地认为自修复是因为自组装行为。我们分别在生物合成溶液（Fig.5a）和biohybrid-coated硅衬底（Fig.5b）中培养酵母细胞，随着扫描电镜时间的延长，可以清楚地看到两组酵母细胞表面合成的聚合物结构由疏松逐渐变得致密。在生物合成溶液环境中的酵母细胞10小时时与8小时对比细胞表面没有明显区别，这表明壳体的厚度不会随着时间的延长而无限增加，同样在另一组情况相同。这表明这种生物合成聚合物即使在硅涂层衬底培养基中可以自组装在细胞表面形成致密的壳体，这是纳米聚合物可以自我修复壳体的原因。

Fig.5

相同的纳米壳体和壳体厚度的形成可能和细胞与生物合成物在细胞表面的电荷和电位有关。细胞的表面电荷和电位是通过电动电势测量的，酵母细胞的电动电势为-17.1plusmn;1.2mV，蓝藻细菌的电动电势为-14.2plusmn;0.8mV，生物合成物的电动电势为-19.3plusmn;0.7mV（Table S2）。封装后的细胞电动电势比正常细胞高（封装的酵母细胞电动电势为-18.5plusmn;1.5mV，封装的蓝藻细菌电动电势为-16.4plusmn;1.4mV）（Table S2）。这意味着封装后的细胞较普通细胞有更好的分散性，这是因为带电的封装细胞相互排斥从而克服了细胞之间聚合的趋势。根据简化的格雷厄姆方程，表面所带正电荷数目和电动电势成正比，在我们提出的模型中，表面带负电荷的细胞可能会吸引静电形成离子对形成三层电子结构。自组装后，生物合成聚合物通过半胱氨酸分子中氨基/羧基与细胞表面的功能官能团（例如氨基、蛋白质中的羧基、多聚糖中的氢氧基）之间的氢键包覆在细胞表面（Fig.6b）。这证明纯净的半胱氨酸分子也可以在细胞表面形成网状聚合物（Fig.S13a，在Fig.S13b中光滑的原始细胞表面作为对比），尽管它不是很稳定。这些相互作用可能导致了纳米聚合物中纳米孔洞的变形，这种结果和之前Fig.1b和S1b的结果相一致。而且，包埋后的酵母细胞由于其和蓝藻细菌相比有较高的表面电荷可以吸引更多的带电的生物合成聚合物，这就导致酵母细胞的表面壳体厚度较蓝藻细菌的薄。从TEM中也可以证实这一点（Fig.1c和4B）。随着壳体厚度的增加，包埋的细胞表面表面电荷会达到平衡，溶液中的生物合成聚合物就不会继续的组装到壳体上（Fig.6a）。细胞增殖时壳体破裂会打破这个平衡，包埋的酵母细胞会吸引并重新组装纳米聚合物来自我修复壳体。这种自修复行为类似于生物体中一个特定的自修复方法，破损的区域会通过摄取外部的前驱体来实现自我修复。例如，硅藻会在细胞分裂时通过吸收环境中的硅来重建硅壳。这个提出的模型与实验结果吻合，通过这个模型可以帮助理解包埋细胞的自我修复行为。

Fig.6

此外，细胞表面带负电的壳体对表面电荷固有特性不会有影响，这避免了传统带正电的聚合电解质壳体对细胞表面的破坏。不同的生物活性分子例如氨基酸和多肽类可以因此很容易的形成自修复的壳体。这些壳体也可以到细胞表面来

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