神经再生支架材料PLGL的合成方法，特性，及生物学价值外文翻译资料

 2022-10-11 20:04:14

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神经再生支架材料PLGL的合成方法，特性，及生物学价值

摘要：一种新型的神经修复材料PLGL已被实验合成。雪旺细胞分别与PLLDA薄膜（对照组）以及PLGL薄膜共培养后的存活状况与生长状况通过MTT比色法及SEM扫描电镜观测进行评估。然后，对与炎症相关的细胞因子例如L-10和TGF-beta;1进行接触角测定，组织学评估和酶联免疫吸附试验测试。测定结果表明，与PDLLA薄膜相比，PLGA薄膜具有更好的亲水性，生物相容性，降解性能和更少的炎症反应。目前研究表明，PLGL支架将满足人工神经支架的要求，并在神经再生领域具有潜在的应用。

关键词：雪旺细胞；PLGL；移植；炎症因子；生物相容性

目录：

  1. 引言

1.1可降解生物材料的发展概况

1.2可降解生物医用材料研究现状

1.3PLGL人工神经支架材料出现

2实验材料和方法

2.1雪旺细胞的分离及纯化

2.2PDLLA薄膜以及PLGL薄膜的制备

2.3接触角测量

2.4雪旺细胞在薄膜表面的增殖

2.5培养后雪旺细胞的扫描电镜表征

2.6动物移植与组织学评价

2.7血清中细胞因子的酶联免疫吸附试验

3结果与讨论

3.1雪旺细胞的形态鉴定

3.2PLGL的核磁共振1H谱

3.3PDLLA薄膜与PLGL薄膜的水接触角

3.4雪旺细胞在薄膜表面的增殖

3.5培养后雪旺细胞的扫描电镜表征

3.6动物移植与组织学评价

3.7酶联免疫吸附法测定炎症相关因子

4总结

  1. 引言

1. 1可降解生物材料的发展概况

许多医学植入装置(如矫形装置和药物控释制剂等)只需短期或暂时起作用，因此，若作为异物继续留在体内，就有长期释放毒性的危险，需要再次手术取出。此外，近年发展起来的组织工程，对与细胞构成复合体的生物材料要求更高。可降解生物医用材料正是适应这类医学应用的需要而发展起来的。这类材料在体内生理环境下可逐步降解或溶解并被机体吸收代谢，因此不需要再次动手术取出;此外，大部分可降解医用材料的组成单元或降解产物是生物体内自身存在的小分子，比非降解材料具有更好的生物相容性和生物安全性。

1.2可降解生物医用材料研究现状

80年代以来，虽然己经有几十种聚合物被提出来作为可降解的生物材料，但迄今只有很少几种被医药管理部门批准用于临床。已商品化的合成可降解材料包括聚轻基乙酸、聚乳酸、聚二氧杂环己酮(PDS)和三次甲基碳酸}(TMC)等。为了进一步满足临床要求，还需要开发更多有实际应用价值的降解材料。在今后10年内，设计和合成新的可降解生物材料仍是一项重要的具有挑战性的工作。

1.3PLGL人工神经支架材料出现

如果提供一个适当的环境以及支架，那么破坏的周围神经就可以再生[1]。目前，自体移植在临床医学上已作为黄金标准。但供体来源是有限的[2]。另外，受体也存在着风险。为了避免这些缺点，人工神经支架已成功发展到用来修复破坏的神经这一领域。PDLLA由于其良好的生物相容性、生物降解性和合适的力学性能已被广泛应用于组织工程。适用于组织工程的材料应该具备良好的生物相容性和降解性，以及较低的或没有炎症反应。PDLLA的细胞粘附能力是不良的。因此，在这项研究中，PLGL被合成制备出来并用核磁共振1H谱表征其存在。然后雪旺细胞分别与PDLLA薄膜以及PLGL薄膜共培养，并对两者中雪旺细胞的形态和增殖进行观察和表征。动物移植与组织学评估进行评价，其目的是为了说明PLGL作为人工神经支架的潜力。

  1. 实验材料以及制备方法

2.1雪旺细胞的分离及纯化

从新生Wistar大鼠中分离出雪旺细胞。所有的实验程序都按照实验室的原则进行。简单地说，大鼠进行了麻醉。大鼠的坐骨神经在微观下被分离并且其神经外膜被小心解剖分离。在DMEM培养基中迅速加入300micro;l 1毫克/毫升的胶原酶，然后移除上清液，将颗粒悬浮于含0.5毫升10%胎牛血清的DMEM培养基中。将神经组织解剖成1立方毫米大小，并将其移植到培养室中，内含DMEM培养基（10%胎牛血清），并放入培养箱中培养（5% CO2，37°C）。这些神经组织被转移到另一个室中进一步纯化，并重复进行了2-3次，以提高雪旺细胞的纯度。

2.2PDLLA膜与PLGL膜的制备

PLGL的制备：首先，由N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸和溴乙酰溴合成出3S-[4-(苄氧羰基氨基）丁基]-吗啉-2，5-二酮（BMD)。然后通过BMD与D,L-丙交酯的共聚反应得到PLGL。PLGL薄膜以及PDLLA薄膜通过相应的方法得到，将其原料用二氯甲烷溶解于直径为150mm的玻璃皿中。溶剂在室温下完全挥发并且将得到的产物放入真空干燥箱中干燥48小时。然后通过

多核傅里叶变换（FT）NMR光谱仪（ARX400)得到PLGL的核磁共振谱。化学位移通过内部的siMe4得到。

PDLLA的制备：为了提高聚乳酸的相对分子质量，常用间接法合成聚乳酸，即在乳酸脱水缩合后将得到的低聚物在三氧化锑、三氟化锑、四氯化锡等催化剂作用下使其解聚制得2，2一二甲基一3，6一二氧代一1,4二恶烷(PLA的环状二酯，简称丙交酷)，然后再加入辛酸锡、二酯锌、四苯基锡、三氟化硼等催化剂使其发生开环聚合反应而制得高相对分子质量的聚乳酸。相对分子质量可由催化剂浓度及聚合体系的真空度来控制。丙交酷制备的机理一般认为是乳酸先聚合成低聚乳酸，然后低聚乳酸裂解产生出环形的丙交酷分子。

2.3接触角测量

PDLLA薄膜和PLGL薄膜亲水性的变化是通过JC2000A接触角测量仪(中国上海中辰）测量其在空气中的接触角来表征的。一滴水（5mu;L）在薄膜上滴在薄膜上引入了接触角，在水滴落在薄膜上的瞬间完成接触角的测量。

2.4雪旺细胞在薄膜表面的增殖

细胞按照上述方法进行培养。细胞在薄膜表面的活力用MTT（溴化噻唑蓝四氮唑）法进行检测。分别培养后的1，3，5，7天去除其上清液。向每个培养室中加入20micro;LMTT溶液（5mg/ml）并在37℃，5%CO2 的条件下培养4h；去除上清液；向每个培养室中加入100micro;L二甲基亚砜（DMSO）。通过自动酶扫描仪（热实验室系统，芬兰）记录其在560nm处的吸光度。并且测量5次取其平均值。

2.5培养的施旺细胞的SEM图像

通过扫描电子显微镜（SEM)观察与雪旺细胞共培养后的薄膜的表面形态。不同的薄膜在接种雪旺细胞后的第三天分别在含有2.5%戊二醛和0.5%多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（Ph=7.4)中固定1h。接着用缓冲液冲洗，将薄膜在1%的四氧化锇溶液中固定1h，然后经过一系列浓度梯度的乙醇脱水后，在脱水临界点使用氟利昂进行干燥，在试样表面通过溅射镀膜仪进行涂金，随后进行扫描电镜检测。

2.6动物移植与组织学评估

这些程序都是在中国湖北省实验动物繁育研究中心进行的。动物护理是在湖北省动物实验伦理委员会批准下进行的。在整个实验过程中，大鼠在室温21°C下，稳定空气湿度环境下进行一个12小时的周期光/暗循环培养。动物们能得到的标准的啮齿类实验的食物和饮用水。

取雄性Wister大鼠二十只（华中科技大学同济药学院），大鼠体重在250-280 g之间，并将其随机分为5个平行组（植入PLGL膜，植入PDLLA膜，空白组，总数N=15），在不同的时间点，用30mg/kg的氯胺酮溶液腹腔注射麻醉大鼠，然后剃除大鼠毛以及用聚维酮碘液进行皮肤消毒，最终使皮肤暴露出来。所有手术均由同一位外科医生执行。

在大鼠皮下组织植入薄膜并用4%的多聚甲醛10%的蔗糖溶液中进行固定，石蜡包埋。组织切片用苏木精-伊红染色法染色后在光镜下观察和检查。

2.7血清中细胞因子的酶联免疫吸附试验

在植入支架后的第一周和第五周，分别取小鼠血液，在800g和4°C条件下离心10min后取其血清。所有样品均在无菌条件下收集并储存在-70℃下。样品分三份进行了酶联免疫吸附试验（ELISA)测定转化生长因子beta;1 (TGF-beta;1)和IL-10,此次实验室用商业ELISA试剂盒（美国加利福利亚州圣地亚哥生物科学）。样品在450nm下的光学密度通过酶联免疫吸附试验仪（芬兰热科学）进行测定。

  1. 结果与讨论

3.1雪旺细胞的形态与测定

在植入4天后，细胞呈细长的双极或多极并且神经突触相互交错。光学倒置显微镜下观察细胞有强烈光线折射（图1）。雪旺细胞在周围神经的生长和再生中发挥重要作用[6-8]。随着组织工程的发展，植入含有雪旺细胞的神经导管可以促进神经轴突的再生。本文在前人研究的基础上[9]，从新生的wistar大鼠的周围神经中分离出雪旺细胞，根据雪旺细胞和成纤维细胞的附着率的不同，雪旺细胞得以分离提纯。

SC的表型标志物的表达，通过免疫组织化学染色方法确定标记S100来评估雪旺细胞的表形特征。图1（a）显示雪旺细胞蛋白S-100免疫细胞化学染色结果。雪旺细胞的S-100蛋白染色出现棕色，成纤维细胞出现浅蓝色。经过净化后的第四天，细胞表现出均匀的形态（如图一（b））。雪旺细胞检出率计算得到95%。此次试验中的雪旺细胞提纯技术使得我们获得了大量的雪旺细胞。

图（1） 图1（a）S-100蛋白免疫细胞化学染色所确定的雪旺细胞形态，（b）为共培养四天后光学倒置显微镜下的图像

图（2）PLGL的1H核磁共振谱

3.2 PLGL的1H核磁共振谱

图二显示了PLGL的1H核磁共振谱。在1H NMR化学位移的delta;/ ppm = 1.232–2.042（Hg），1.542–1.564（Hg）、3.147（He），4.106–4.128（HB）、4.651（HA），5.161–5.183（HC）、5.297（HF），这证实了PLGL被合成出来。

3.3 PDLLA以及PLGL水接触角测定

表1显示了PDLLA膜和PLGL膜不同的水接触角。在薄膜表面的不同位置测量3次，通过取平均值来计算其接触角的值。从表1中可以看出，PDLLA膜的水接触角大于PLGL膜的水接触角。因此，与PDLLA膜相比，PLGL膜具有更好的亲水性。

Film

Contact angle to water /(° )

PDLLA

84.5 1.5

PLGL

52.6 0.79

表（1）PDLLA薄膜和PLGL薄膜的水接触角

3.4 雪旺细胞在薄膜表面的增殖

用MTT比色法检测雪旺细胞在薄膜上的活力。图（3）显示，在PLGL上培养1，3，5，7天后的雪旺细胞的吸光度要分别大于这些在PDLLA上培养的（Plt;0.05）。因此，雪旺细胞活力表明PDLLA薄膜和PLGL薄膜对雪旺细胞的生长与增殖没有不良影响。然而，相比PDLLA薄膜，PLGL薄膜上的雪旺细胞的活力显然更高。

图（3）通过MTT法测定施旺细胞在薄膜上的活性

3.5雪旺细胞的SEM表征

通过扫描电镜分析雪旺细胞在PLGL薄膜和PDLLA薄膜上的细胞形态和细胞粘附情况（图4）。在这两种薄膜上观察到了雪旺细胞典型的形态特点即主轴和扁平型模式。然而，在PLGL薄膜上更好的粘附条件使得在其表面观察到了更多的施旺细胞。同时，在PLGL薄膜上的雪旺细胞保持着类似主轴形态的原代培养。

图（4 ）扫描电镜下施旺细胞在PLGL薄膜以及PDLLA薄膜上的图像

3.6动物移植与组织学评价

所有用作实验的动物都存活下来，并且没有并发症。手术伤口愈合正常。当手术部位在手术后5周暴露，PLGL薄膜被发现降解成一些碎片（图5（a），红色箭头）。根据HE染色表征，PDLLA组相比于PLGL组而言，皮下组织表现出更多的多核巨细胞以及巨噬细胞（图5（b），红三角），这表明了PLGL膜具有较少的炎症反应和良好的组织相容性[13]

图（5） a为坐骨神经植入PLGL薄膜后的显微镜图像 b植入PLGL薄膜后HE染色图样

c植入PLGL薄膜HE染色图样

3.7酶联免疫吸附法测定炎性因子

目前，有报道称IL-10能减少疤痕的形成并且能增强坐骨神经修复再生，以及具有抗炎症作用[14]。在炎症状态下，TGF-beta;1同样起着重要的作用。TGF-beta;1 在IL-6存在下能驱使辅助性T细胞（Th17）分化，可促进进一步的炎症和增强自身免疫条件。TGF-beta;1 编排修复性T细胞和辅助性T细胞的分化有浓度依赖性。此外，TGF-beta;与IL-4结合起来会促进IL-9和IL-10细胞的分化，缺乏抑制功能并且会促进组织炎症。

在手术后1周，PLGL组体内的TGF-beta;1含量低于PDLLA组的含量，并且IL-10的含量高于PDLLA组（图6）。当手术进行5周后，全部组的类似的IL-10含量都记录。同时，PLGL组中TGF-beta;含量分别为

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