基于原位交联壳聚糖-透明质酸的 可注射腹部组织再生水凝胶外文翻译资料

 2022-08-04 19:40:33

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中文名称 基于原位交联壳聚糖-透明质酸的

可注射腹部组织再生水凝胶

摘要：开放性腹部(OA)或腹部创伤引起的腹壁缺损是一个严重的问题，它会引起多种临床问题。尽管常用的假体材料多种多样，但会引起宿主软组织反应、瘘管形成和慢性患者不适的并发症。近年来，大量的天然聚合物被用于合成可注射的水凝胶，用于组织再生。本研究制备了壳聚糖-透明质酸(CS/HA)水凝胶，并研究了其对腹部组织再生的影响。该水凝胶的物理和生物学特性被证明是适合应用于腹部伤口。与对照组和纤维蛋白凝胶组相比，在模拟开腹和腹壁大面积缺损的大鼠模型中，应用水凝胶后细胞反应迅速，ECM沉积充足，新生血管明显。并进一步对这些发现的可能机制进行了研究，CS/ HA水凝胶组参与血管生成和细胞反应的细胞因子增加，并向具有抗炎和组织修复功能的M2巨噬细胞倾斜。这些结果表明，CS/HA水凝胶可以预防并发症，并有希望用于腹部组织再生。

  1. 概述

假体材料已被广泛应用于剖腹术后疝修补和临时腹闭合4、5。合成的不可生物降解生物材料如聚丙烯(PP)和聚乙烯网由于其优异的力学性能而被广泛使用。然而，由于它们的生物相容性较差，单独放置这些材料可能会引起宿主软组织反应、瘘管形成和慢性患者不适6 - 8。

组织工程旨在利用生物可降解材料或支架，使组织生长和重塑，以促进伤口修复和组织再生。多种可注射水凝胶已被用作组织工程的传递系统、细胞载体和支架9 - 11。可注射水凝胶具有良好的延展性和填充性，适合不规则伤口。用于制备可注射原位形成水凝胶的方法从光聚合到化学交联不一而足。然而，化学交联剂的长时间辐照和毒性极大地限制了其应用。最近，几种多糖如右旋糖酐、硫酸软骨素和透明质酸(HA)被部分氧化，然后与氨基反应形成可注射的原位水凝胶，可能用于软骨组织工程和粘连预防等医学应用。

图1 (A)席夫碱反应制备CS/HA水凝胶的示意图，化学结构的壳聚糖(CS) (a),羧甲基壳聚糖(给)(c)、透明质酸(HA) (b)和醛透明质酸(AHA)(d)。(B)动物模型和实验过程的示意图:(a)腹壁缺损模型,对照组(b), (c)纤维蛋白凝胶或CS /公顷水凝胶使用缺陷,(d)纤维蛋白凝胶或CS /公顷水凝胶组。(C)大体观察:(a、d)建立缺损创面，(b)对照组(黑色箭头:PP补片)，(c、e)使用纤维蛋白凝胶或CS/HA水凝胶(绿色箭头:纤维蛋白凝胶或CS/HA水凝胶)，(f)纤维蛋白凝胶或CS/HA水凝胶组。

HA是一种由N -乙酰- D葡萄糖胺和D -葡萄糖醛酸重复二糖单元组成的线性糖胺聚糖。血凝素广泛存在于人体内，是细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的主要成分。由于其良好的生物相容性和生物降解性，HA在药物传递、伤口愈合和组织工程方面显示出了出色的应用潜力13,16 - 18但HA的快速降解影响了其在组织工程中的有效性。壳聚糖(CS)是由几丁质部分去乙酰化的衍生物，由氨基葡萄糖和n -乙酰氨基葡萄糖组成。CS由于其生物相容性、生物降解性、无毒性和良好的细胞结合能力等生物学特性，已被广泛应用于组织工程、伤口愈合等生物医学应用。但CS在生理溶剂中的溶解度较差，这极大地限制了其作为可注射支架的进一步应用。近年来，CS和HA经过一些修饰，已被用于开发用于预防粘连和牙周组织工程的复合水凝胶15,23,24。然而，还没有研究证实CS/HA水凝胶促进腹部组织再生的潜力。我们之前的研究已经证明，预先形成的水凝胶有可能加速开放腹部伤口肉芽组织的形成25。在这里，我们生产了一种可注射的CS/HA水凝胶，旨在评估其对腹部组织再生的影响。对其化学合成、微观形貌、平衡膨胀和体外降解进行了研究。体外将成纤维细胞包裹在水凝胶中，以评估细胞相容性和作为细胞载体的潜在适用性。此外，还对其促进大鼠腹腔组织生长的有效性及其可能的机制进行了详细的研究。为了控制起见，同样对商业纤维蛋白凝胶进行了评估。

二．结论

2.1多糖衍生物的结构

用羧甲基化法合成了N,O -羧甲基壳聚糖(NOCC)。将羧甲基引入壳聚糖的N端和O端。壳聚糖的胺基与一氯乙酸的亲电碳原子发生反应。二是壳聚糖的羟基与一氯乙酸的亲电碳原子之间。CS和NOCC的化学结构如图1A所示。测定的NOCC取代度为95%，在PBS(7.4)中表现出良好的水溶性。用NaO4氧化透明质酸，制得醛透明质酸(A-HA)。HA的邻近羟基被氧化成二醛，从而打开糖环形成二醛衍生物。用盐酸羟胺滴定法测定A-HA的实际醛含量，氧化程度为48.9%。其成胶机理是NOCC的氨基与A-HA的醛基发生席夫碱反应。与A-HA交联的酰胺键的形成导致了水凝胶中多孔结构的形成。

图S1A显示了CS、NOCC、HA和A-HA的FTIR光谱。与CS的光谱相比,给显示的光谱特征峰(1608厘米minus;1)相关的羧酸盐和一个特征峰(1421cmminus;1)代表的对称拉伸羧酸盐C = O。此外，与CS相比，NOCC的羧甲基化峰强度比(1029 cmminus;1/1057 cmminus;1)有所降低，这表明NOCC的C6位置的羧甲基基团被-CH2-OH取代。HA和A-HA的光谱非常相似，没有检测到与醛官能对应的信号，这可能是由于形成了半缩醛。在886 cmminus;1处的特征峰为CS/HA水凝胶的半缩醛结构。

2.2水凝胶的成胶时间

用A-HA交联NOCC制备了CS/HA水凝胶。采用试管倒置法测定不同CS/HA摩尔比水凝胶的成胶时间，见表S1。凝胶时间从70 s到2400 s不等。随着A-HA浓度的增加，凝胶时间明显缩短。当摩尔比为1:2 (NOCC/A-HA)时，凝胶时间小于2分钟，适合注射在腹壁缺损处，能完全覆盖缺损，与缺损紧密粘附。因此，应用该配方进行以下研究。考察了CS/HA水凝胶的流变性能。应变相关的振荡流变(图S1B)表现为一个宽的线性粘弹性区域，具有很强的抗剪切能力。只有当应变超过100%时，水凝胶的网络才会被破坏，这表明水凝胶具有剪切变薄的行为。频率相关的振荡剪切流变学(图S1C)表明，G 在观察到的频率范围内占主导地位，这表明一种类似水凝胶的行为。随时间变化的振荡流变学显示G 和G '是时间的函数(图S1D)。随着时间的推移，G 和G '增加，且G 的增加速度大于G '。当G 大于G '时，以凝胶时间为凝胶点(tgel = 90 s)。

CS/HA水凝胶的形貌。用扫描电镜对冻干CS/HA水凝胶的微观形貌进行了表征。图S2为水凝胶的横截面图像。结果表明，CS/HA水凝胶具有连续的多孔结构，这种内部结构可能有利于营养的渗透和细胞的生长。

CS/HA水凝胶的平衡膨胀和降解。用PBS (pH = 7.4)重量法测定冻干CS/HA水凝胶的平衡溶胀比(图S3A)。从图中可以看出，溶胀率在前2小时内迅速增加，之后溶胀率下降。培养6小时后，干燥的水凝胶重量增加34.8倍，达到平衡膨胀。以37℃PBS (pH = 7.4)孵育时间测定冻干CS/HA水凝胶的降解情况(图S3B)。在孵育过程中，可以清楚地观察到水凝胶样品的尺寸变小。由于溶胀效应，第一天降解速度较慢。随后，水凝胶经历了更快的降解行为，在第7天观察到水凝胶的失重超过60%。

2.3体外细胞相容性

由于成纤维细胞在肉芽组织形成和组织再生中起着重要的作用，因此采用CS/HA水凝胶包封成纤维细胞，以探索其细胞相容性和细胞毒性。从活/死染色的细胞来看，大多数被包裹在水凝胶中的成纤维细胞在培养12、24和48小时后仍能存活(图2)，椭圆形或圆形成纤维细胞均匀分布在水凝胶中。培养48h后，死亡细胞相对增多，但细胞活力仍保持在90%以上。结果表明，CS/HA水凝胶具有良好的细胞相容性和无毒特性。CS/HA水凝胶相互连通的多孔结构允许营养物质和氧气渗入，为成纤维细胞提供了适宜的环境。

2.4组织学分析

腹腔再生组织在第7天完全形成，这与我们之前的研究一致25。再生组织和肠袢用Hamp;E和Masson三色染色(图3和图S4)。在CS/HA水凝胶中，观察到更快的组织再生反应，其特征是更多的细胞积累和基质沉积。Hamp;E染色显示结缔组织区域和下层肠道。计算再生组织的相对厚度。CS/HA水凝胶诱导再生组织厚度增加约2.5倍，可见大量成纤维细胞和内皮细胞。高倍镜显示内部组织。毛细血管分布在再生组织中，与对照组和纤维蛋白凝胶相比，CS/HA水凝胶中毛细血管分布较多。Masson三色染色显示了再生组织中胶原沉积的整体分布，CS/ HA水凝胶中胶原纤维的数量和密度均有所增加。

2.5新生血管形成

用CD31免疫染色评估再生组织中的血管密度，用alpha;-SMA免疫染色显示平滑肌细胞的存在(图4和图S5)。对照组中CD31阳性染色较少，而纤维蛋白凝胶和CS/HA水凝胶中CD31染色明显。这些结构在CS/HA水凝胶中分布明显。双阳性免疫染色显示CD31阳性结构多被alpha;-SMA阳性细胞包围。CD31与alpha;-SMA染色的空间关系提示血管形成成熟。

2.6细胞外基质沉积

波形蛋白免疫荧光染色和col1a2揭示了细胞外基质(ECM)沉积在结缔组织的形成(图5),胶原蛋白沉积在纤维蛋白凝胶(1.92plusmn;0.08和1.00)和CS /水凝胶(2.50plusmn;0.06和1.00),而隐性对照组,与组织学分析的结果一致。双免疫荧光染色显示，表达波形蛋白的成纤维细胞内及周围均有胶原表达。空间定位表明胶原蛋白的主要表达来源是成纤维细胞。此外，对于胶原的角状分布，与对照组胶原纤维的随机取向相比，CS/HA水凝胶对胶原的定向排列程度较高。

图2。CS/HA水凝胶的体外细胞相容性研究。活/死染色被包裹的L929成纤维细胞12 h (A)、24 h (B)、48 h (C)。(D)不同培养时间的细胞存活率。

2.7巨噬细胞表型

对泛巨噬细胞(CD68)、促炎M1巨噬细胞(CD86)和重塑M2巨噬细胞(CD206)进行免疫荧光染色，研究CS/HA水凝胶对巨噬细胞极化的影响(图6A)。三组M1促炎细胞数量相似(图6B)。然而，CS/HA水凝胶显著增加M2细胞数量(图6B)。更高比例的M2/M1表明M2细胞偏多(图6C)。

为了进一步研究巨噬细胞极化的可能机制，我们检测了STAT1和STAT6的磷酸化水平(图7)。免疫组化检测显示，与对照组相比，纤维蛋白凝胶和CS/HA水凝胶再生组织中的STAT1磷酸化水平下降。相反，在纤维蛋白凝胶和CS/HA水凝胶中发现STAT6磷酸化相对增加(图7A)。western blot结果与上述结果一致(图7B和S6)。CS/HA水凝胶p-STAT6显著升高，p-STAT1显著降低(图7C)。

2.8基因的表达

通过qPCR分析参与组织形成过程的基因(图8)。促炎相关因子白细胞介素(IL)-6和肿瘤坏死因子(TNF)-alpha;在对照组中显著升高，而在纤维蛋白凝胶和CS/ HA水凝胶中显著诱导了抗炎因子IL-10和IL-4。与纤维蛋白凝胶和对照组相比，CS/HA水凝胶显著上调IL-4的表达。纤维蛋白凝胶和CS/ HA水凝胶中单核细胞趋化蛋白(MCP)-1表达均增强。营养因子和纤维成形相关因子检测碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和转化生长因子(TGF)-beta;。与对照组相比，纤维蛋白凝胶和CS/HA水凝胶中TGF-beta;和bFGF明显释放。与纤维蛋白凝胶相比，CS/HA水凝胶中TGF-beta;的分泌更为显著。此外，CS/HA水凝胶中血管生成相关因子VEGF显著增强。

2.9结果与讨论

ACS引起的OA和外伤性损伤导致的腹壁组织丢

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