疏水表面固定PEO-PPO-PEO三嵌段共聚物及其对蛋白质和血小板的影响：结合QCM-D（耗散型石英晶体天平）及DPI（双极化干涉测量法）的研究外文翻译资料

 2022-10-11 20:03:02

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疏水表面固定PEO-PPO-PEO三嵌段共聚物及其对蛋白质和血小板的影响：结合QCM-D（耗散型石英晶体天平）及DPI（双极化干涉测量法）的研究

摘要：DPI用于监控四种Pluronics在疏水表面的固化动态并用于表明嵌段共聚物构想对于蛋白质吸附的影响。疏水链段的比例而不是其长度会影响嵌段共聚物的链密度。Pluronics的固化密度取决于PEO在水溶液中的水合作用与PPO在基底上的疏水作用之间的竞争。由于疏水作用为主要影响因素，P-123获得了最大的接枝量（2.89 plusmn;0.25ng/mm2）。P-123的疏水段在C18基底上固化逐步缓慢进行。在P-123拥有最大的疏水链段比例（PPO/PEO=3.63）并形成分子刷结构时表现出极佳的抗蛋白质和血小板吸附能力。QCM-D的结果也进一步证实：基底上P-123中的PEO结构表现为相对伸展的分子刷链，而L-35则表现为相对松散平展的结构。P-123中的PEO规整结构以保持原始构象并阻止对牛血清白蛋白（BSA）的吸附。因此，固化Pluronics的血液相容性受疏水链段的比例及PEO构象的影响。

关键词：DPI，QCM-D，Pluronics（PEO-PPO-PEO三嵌段共聚物），蛋白质吸附，血小板粘附

1.绪论

Pluronics是包含一个中心疏水聚环氧丙烷和两个末端亲水聚环氧乙烷链段的共聚物。这些共聚物因其抗蛋白质吸附，抗细胞结合以及对血细胞的低毒性而受到各个医学领域越来越多的关注。生物医用Pluronics已可在疏水基底上固化，如聚乙烯，聚砜和硅烷化疏水表面。近期对于Pluronics的研究集中在血液相容性上，例如血小板粘附，红细胞变形和蛋白质吸附。中心的PPO吸附在疏水表面上，两侧的PEO片段则在水溶液中形成一个空间位阻层。因此，三嵌段共聚物的内部结构给处在血流及静脉环境中的材料提供了有效的保护，这对于生物材料的血液相容性十分重要。

蛋白质吸附试验是血液接触型材料在血液相容性上的重要指标。Green等人报道：Pluronics的抗蛋白质吸附能力取决于PPO在疏水表面的粘附力而不是亲水的PEO链的长度。早期的研究认为短链PEO表现出不良的抗蛋白质吸附能力是由于其较弱的空间排斥力。固化Pluronics的构象也对其血液相容性有影响，尤其是抗蛋白质吸附能力。Schroen等人发现Pluronics在疏水和亲水表面上具有不同的PEO构象。Pluronics中的PEO组份在亲水表面被

吸附形成一个平展的结构。中间的PPO段也吸附在疏水表面；PEO漂浮组份则在水中伸展形成分子刷结构。典型的例子是分子刷结构与平展结构相比，因其较大的空间排斥力而表现出较好的抗蛋白质吸附能力。然而，当Pluronics吸附在疏水表面时，其分子刷结构的形成是不确定的。这个不确定性是分子刷结构对于Pluronics结构，固化动力学以及稳定性的依赖造成的。这些因素对于接下来要讨论的蛋白质吸附能力也十分重要。

将本次研究中，我们使用了双极化干涉测量法（DPI）结合耗散型石英晶体天平（QCM-D）来监控四种不同PPO/PEO链段比例的Pluronics的固化过程并研究蛋白质与表面实时的相互作用。表面等离子共振技术和原子力显微镜被用于即时分析蛋白质与Pluronics间的相互作用。作为一个光学技术，DPI通过堆叠的导波管发射横向的电磁偏振光。波导干涉仪将会测量有效的折射率分布，从而得到被测物的干质量，厚度和密度。QCM-D是一种敏感的免标记生物传感器，用于实时分析生物化学分子的行为。由QCM-D得到的频率（Delta;fnof;）和损耗值（Delta;D）我们可以确定吸附的蛋白质质量，交联的溶液质量和吸附层黏度。这两项技术分别用于研究蛋白质吸附；而两项技术的结合已被用于确定高分子链和生物大分子之间的相互作用。

本次研究旨在分析Pluronics在疏水表面的固化动力学并使用DPI确定固化效率以及Pluronics的结构对蛋白质吸附能力的影响。这些模型表面的血液相容性可以由其蛋白质吸附和血小板粘附情况来评判。我们使用QCM-D监控频率和损耗值间的关系，并以此确定Pluronics在蛋白质吸附过程中链结构的变化。本项研究为制造血液相容性的Pluronics表面提供了理论依据。

2.材料与实验

2.1.材料

所有的Pluronics购于Aldrich.Inc。牛血清白蛋白（BSA）和纤维蛋白原（Fib）购于Sigma Chemical Co.缓冲体系采用即时配置好的磷酸盐缓冲溶液（PBS 15mM NaCl，0.01M磷酸盐缓冲剂，pH7.4）。所有的蛋白质和Pluronics经PBS缓冲液处理。其他试剂均为分析纯，使用时未进一步纯化。所有的溶液采用电阻率不低于18MOmega;cm的去离子水制备。氮氧化硅（FB80，Farfield，Sweden）和二氧化硅（QSX303，Q-Sense，Sweden）感应芯片分别用于DPI和QCM-D实验。

2.2.DPI测量

DPI实验使用的是Analight Bio200 DPI（Farfield Group Ltd.，Creve，UK）。DPI实验中将使用氨基薄片。未修饰的薄片首先在80℃下浸泡于食人鱼洗液（98wt%浓硫酸和30%双氧水体积比为7:3）中30min。接着，使用超纯水冲洗薄片并用高纯氮气吹干。在将未修饰的薄片浸入无水甲苯（ge;99.8%纯度）中前，需将其于培养皿使用氮气完全干燥。将溶液搅拌30s后，取出薄片直接放入另一洁净干燥装有2%十八烷基三氯硅烷无水甲苯溶液的玻璃皿中。薄片需在硅烷化溶液中放置2h，然后用过量无水甲苯冲洗。接着使用高纯氮气吹干，放入105℃的烘箱烘干10min。于是就得到了疏水基底（C18）。

在C18上的Pluronics固化以及接下来的蛋白质吸附过程由Analight Bio200 双偏振干涉仪（Farfield Group Ltd.，Creve，UK）表征，该仪器包含一个双平板波导传感芯片，并由极化的He-Ne激光束交替照射。C18片装入仪器，每个薄片有两条基板内刻蚀流体通道，通道1和通道3，以便于同时进行两个平行实验。仪器温度稳定在20℃（plusmn;0.001℃）。Pluronics在疏水表面固化及接下来的蛋白质吸附方案如图1所示。首先以50mu;L/min的流速注入脱气的PBS缓冲溶液直至得到稳定的基线。然后是注入脱气的80%质量分数的乙醇/水混合液，接着是10min的脱气超纯（UHQ）水，流速均标定为50mu;L/min。这之后以相同流速注入 PBS缓冲溶液。待基线再次稳定后，以30mu;L/min的流速注入Pluronics的PBS溶液（1mg/mL）持续5min，再用PBS缓冲溶液冲洗。接着将BSA（1mg/mL）和纤维蛋白原（0.1mg/mL）的PBS溶液分别注入通道1和通道3，流速为15mu;L/冲洗以min持续10min并用PBS冲洗以除去物理吸附的蛋白质。实验后，清洗仪器时先使用4%（g/mL）的Hellmanex溶液(Hellma GmbH amp; Co.)以50mu;L/min的流速冲洗至少2h，再使用50%（g/mL）的异丙醇水溶液以相同流速冲洗至少2h。最后将流速改为25mu;L/min清洗仪器一整晚。

在DPI工作时，横向电场（TE）和横向磁场（TM）信号会被实时记录。层厚和折射率（RI）可以由AnaLight reg;软件(AnaLightreg; Resolver software, version 2.1.4)分析得出。吸附质量则由下列De Feijter公式计算得到：

（1）

（2）

式中mL是单位面积的层质量(ng/mm minus;2 )，tau;L是层厚（nm），nL和nbuffer分别是吸附层和本体溶液的折射率（RI）。dn/dc是蛋白质在本体溶液中的RI的增量。在所有的运算中将会使用0.183cm3g-1作为蛋白质RI增量的标准值。

2.3.QCM-D测量

本次QCM-D测量由配备有四个平行传感器室QCM-D E4型试验仪(Q-Sense, Gothenburg, Sweden)完成。可以得到传感器表面的共振频率Delta;fnof;和耗散值Delta;D。所有实验在20.0 plusmn; 0.1℃的环境下进行并使用AT截法表面包覆了金电极的石英晶体。传感器的基本共振频率为5MHz。

2.4.由QCM-D测试Pluronics的固化过程及蛋白质吸附

Pluronics在洁净的疏水C18传感器表面固化。二氧化硅传感器(QSX 303)上疏水层的修饰方法与DPI实验相同。以30mu;L/min的流速将Pluronics的PBS溶液(0.1%, w/v)注入传感器室持续30min，再用PBS冲洗。接着是以30mu;L/min的流速将BSA蛋白的PBS溶液(1 mg/mL)注入传感器室持续60min用于蛋白质吸附。

2.5.数据分析

所有频率和耗散值的变化都被记录下来，在工作过程中频率的变化由第三倍频峰Delta;fnof;3呈现。固化的Pluronics的质量和厚度由Q-tools软件包中的Voigt模型进行建模处理。其中要使用的参数有层密度(1200 kg/m3)，流体密度(1000 kg/m3)，层粘度(0.0001–0.1kg/ms)，层剪切模量(103–105Pa)，层厚(10-11–10-6)。第三、五、七、九倍频峰将会用于所有的拟合运算。

3.结果与讨论

3.1.PEO-PPO-PEO在疏水表面的固定

四种不同PPO与PEO比例的Pluronics固化在疏水硅片表面（C18）。表1显示了几种Pluronics的物理性质。所有的Pluronics不能在20℃的水溶液中形成胶粒，防止其以单分子链的形态固化在疏水模型表面。疏水链段比例[环氧丙烷(PO)/环氧乙烷(EO)]定义为在三嵌段共聚物PEO-PPO-PEO中PO和EO的链段数的比例。P-123拥有最大的PO/EO值：3.63。而F-68和F-108都拥有相近的疏水比例：0.38。

Pluronics在C18基底上的固化过程由DPI实时监控。固化的Pluronics的接枝密度和厚度如表2所示。链密度由下式计算得到：

（3）

链密度是Pluronics单位面积的链数。Mw是Pluronics的分子量，Nalpha;是阿伏伽德罗常数，Г是Pluronics在基底上的固化质量。P-123在所有样品中有最大的链密度

（0.303nm-2）。F-68和F-108虽然有相近的PO/EO值， 但是由于分子量的不同F-68的链密度（0.064nm-2）是F-108链密度（0.038nm-2）的近两倍。其结果与PO/EO值（表1）一致，显示出是疏水链段的比例而不是疏水链的长度影响Pluronics的链密度。

3.2.PEO-PPO-PEO的固化动力学

在C18表面的四种Pluronics的厚度，质量和密度由DPI（图2A）测定用于分析PO/EO值对于PEO-PPO-PEO的固化动力学的影响。L-35和P-123的厚度与质量一致在12s是出现一个峰值，而F-68和F-108则是单调递增的。Pluronics在C18表面的等比例模型图像要低于相应的DPI数据。我们忽略EO链长的影响并测定疏水链段对于固化动力学的影响。当PO/EOgt;1时，P-123和L-35的厚度迅速上升并在达到峰值后逐渐下降，最后稳定在某一值（图2A）。P-123的PO/EO值为3.63拥有最大的接枝链密度，由于强烈的疏水作用，疏水链段固定在C18基底表面是一个缓慢逐步的过程。Biggs等人研究表明多肽在无电荷固体表面吸附是通过一种分子水平的“统计拉链式配对”过程实现的。P-123在C18基底上的固定机理与多肽吸附类似。DPI测定的逐步过程以及图形演示如图2B所示。P-123扩散到C18基底表面，由于疏水作用一个疏水端固定到基底上；此时，其厚度超过4nm（图2B）。峰值取决于PEO在水溶液中的水合作用和PPO在基底上的疏水作用之间的平衡。接着随着时间的过去固定的PO在C18基底上通过逐步重排向四周展开。厚度由于增强的疏水作用而降低，质量的轻微减少是由于P-123链之间的空间位阻效应。最终，P-123完全固定在基底表面；PEO悬浮于水溶液中，厚度和质量的变化相对平稳。

虽然P-123（19EO）的EO链长明显小于F-68（80EO））和F-108（148EO）（表1），但P-123的稳定厚度（3.77plusmn;0.03nm）比其他样品的值要高（表2）。P-123的PEO在基底上呈现出伸展的分子刷结构，这是由于在C18基底上相对密集的PEO链之间的相互排斥。虽然L-35的PO/EO值较另两种要高，但其质量和厚度却是四种样品中最低的（表2）。一方面，L-35的疏水段数（16PO）与亲水段数（11EO）几乎相同。这个结果造成了L-35的链密度波动，L-35中PEO在水溶液中的水合作用抵消了PO链段与C18基底之间的疏水作用并且减小了在C18基底上的固定质量。另一方面，L-35的疏水链数只有16，这使得L-35在基底上的固定复杂化。虽然L-35（0.231nm-2）的链密度要高

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