用于生物活性分子控释的多响应动态壳聚糖基水凝胶的合成外文翻译资料

 2023-02-25 13:31:49

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用于生物活性分子控释的多响应动态壳聚糖基水凝胶的合成

摘要：研制出一种廉价、简便、环境友好的方法来制备多响应、动态和自修复的壳聚糖基水凝胶。合成了端二苯甲醛遥爪聚乙二醇(PEG)，并在醛基和壳聚糖的氨基之间形成了席夫碱键。在20℃下将遥爪PEG与壳聚糖混合后，在60s内迅速生成固含量为4-8%的水凝胶。由于席夫碱键与醛类和胺类反应物之间的动态平衡，水凝胶对许多生化刺激如pH、氨基酸和维生素B6衍生物具有自修复性和敏感性。此外，壳聚糖可以被木瓜蛋白酶等酶消化，导致水凝胶的分解。小分子如罗丹明B和蛋白质如溶菌酶的包封和控制释放已经成功实现，表明了这些壳聚糖基动态水凝胶的潜在生物医学应用。

1.引言

水凝胶通常是通过聚合物链之间的共价或非共价交联来制备的。由于共价交联水凝胶是不可注射和不可自修复的，因此其生物医学应用受到限制。非共价交联水凝胶是通过聚合物链间的瞬时和弱的相互作用形成的，通常会导致水凝胶的可逆形成。因此，非共价交联水凝胶是许多生物医学应用的理想材料。例如，蛋白质工程物理水凝胶是最近通过特定肽结构域之间的蛋白质-蛋白质相互作用而发展起来的。这些水凝胶是可注射的，可自修复的，适合于三维神经干细胞生长。艾达集团还发现，在没有外部诱因如热或光的情况下，通过黏土与树枝状交联剂的简单混合，2-3%固体质量的高含水量水凝胶通过静电作用在3分钟内迅速形成。所制备的水凝胶不仅具有良好的机械强度和快速自修复能力，而且还保留了嵌入蛋白质的生物活性。通过非共价键连接制备水凝胶赋予了水凝胶自修复性和可逆性等特殊性能，成为开发新型生物医学材料的重要策略。

壳聚糖是一种聚阳离子生物聚合物，通常由甲壳素碱性脱乙酰反应而得，甲壳素是节肢动物外骨骼和真菌细胞壁的主要成分。与年产量8000万吨的合成聚乙烯(PE)相比，在生物圈中持续存在着超过100亿吨的甲壳素。因此，壳聚糖是一种重要的绿色可再生材料。它通常是无毒的，生物相容的，和生物可降解的，并已被用于许多医药和医疗用途，如牙周和植入手术，局部眼部应用，和注射。由于壳聚糖在生理pH值下带正电荷，它也被用作生物粘合剂和非病毒载体来传递基因。此外，壳聚糖具有抑菌作用，已被发现可促进伤口愈合。壳聚糖基水凝胶已经得到了广泛的研究，其中大部分是通过共价键连接制备的。非共价壳聚糖基水凝胶也通过离子、聚电解质、高分子间复合物、疏水缔合等相互作用制备而成，其中凝胶的形成是可逆的。然而，可逆性和自修复性共价交联壳聚糖基水凝胶的报道较少。在此，我们报道了一种以壳聚糖和双官能化聚乙二醇(DF-PEG)为主要成分制备壳聚糖基动态水凝胶的廉价、快速、简便的方法。PEG链末端的两个羟基被苯甲醛官能化，可以通过可逆的席夫碱(也称为亚胺，-N=CH-) 键与壳聚糖交联，形成动态水凝胶(方案1)。

壳聚糖与乙二醛、戊二醛等小分子二醛的交联直接制备水凝胶的方法已经被报道。然而，小分子二醛的毒性往往限制了这些水凝胶的药物应用。例如，乙二醛具有诱变作用，戊二醛具有神经毒性。聚乙二醇（PEG）是为数不多的水溶性、无毒、生物相容性好的聚合物之一。因此，开发了聚乙二醇的双醛衍生物来解决这一毒性问题。Dal Pozzo等人将聚乙二醇与壳聚糖连接，通过形成亚胺键形成非动态水凝胶，然后进行还原胺化反应，形成稳定的N-C单键。然而，由于还原剂的要求(如NaCNBH3)和较长的反应时间(24h)使其成为一种不方便的合成方案。与不稳定的脂肪族席夫碱相比，芳香族席夫碱要稳定得多，因此本研究选择苯甲醛基团修饰PEG链末端，使其与壳聚糖主链上的氨基发生反应，在不添加还原剂的情况下构建水凝胶网络。水凝胶在20℃的温和条件下，60秒内立即形成(详见配套资料视频)。由于席夫碱键与醛类和胺类反应物之间存在固有的动态平衡，所以聚乙二醇与壳聚糖链之间的相互作用可以看作是假共价键。亚胺键的解偶合(即水解)和重新偶合在水凝胶网络中动态发生，赋予水凝胶自修复能力。由于席夫碱的不稳定性，动态水凝胶对许多化学和生物刺激都很敏感，如pH、维生素B6衍生物、氨基酸和酶。这些刺激可以引起席夫碱平衡的改变，导致水凝胶最终液化(方案2)。值得注意的是，维生素B6、氨基酸、某些壳聚糖消化酶(如胃蛋白酶、脂肪酶)是生理系统中的常见元素; 因此，壳聚糖基动态水凝胶具有作为药物控释载体的潜力。

本研究将罗丹明B和溶菌酶作为模型药物加入水凝胶中，并在各种生物和化学刺激下对动态水凝胶中的模型药物进行控释。所有结果表明，我们成功地开发了一种简单和环境友好的方法来制备壳聚糖基动态水凝胶，并随后从这些水凝胶系统中控制药物释放。

2.实验部分

2.1材料。聚乙二醇（重均分子量2000，国药化学试剂，96%），聚乙二醇甲醚（mPEG，重均分子量1900，阿法埃莎，97%），壳聚糖（济南海得贝生物工程，脱乙酰度85%），N,Nrsquo;-二环己基碳二亚胺（DCC，Sigma，99%）, 4-二甲氨基吡啶（DMAP，Aldrich，99%），木瓜蛋白酶（Sangon Biotech gt; 2000 u/mg），盐酸吡哆醛 (PL-HCl, Sangon Biotech gt; 99%)，罗丹明B (Sigma,sim;95%),溶壁微球菌（Ml cell,Sigma）和溶菌酶（取自鸡蛋清，Sigma，88015u/mg）购买使用。四氢呋喃（THF）储存在钠的氮气气氛中，在使用前进行蒸馏。

2.2测量和统计数据分析。在JEOL 300MHz光谱仪上记录了核磁共振氢谱。多重性报告为单重态（s）、宽单重态（bs）、双重态（d）、三重态（t）和多重态（m）。使用Perkin-Elmer光谱100红外光谱仪进行红外光谱分析。在Perkin- Elmer LAMBDA 35 紫外/可见光谱系统上记录了紫外-可见吸收光谱。在TA-AR2000ex平行板流变仪（直径40 mm）上进行了37℃下的流变学分析。采用SPSS 15.0进行了统计数据分析。

3.研究方法

3.1双官能化聚乙二醇(DF-PEG)的合成。将PEG2000（3.26g，1.63mmol）、4-甲酰苯甲酸（0.98g，6.52mmol）和DMAP（0.050g）溶解于100mL干燥THF中，然后在氮气气氛下加入DCC（1.68g，8.15mmol）。将体系在20℃下搅拌18h，然后过滤白色固体。该聚合物在四氢呋喃中反复溶解，在乙醚中沉淀三次，形成白色固体。干燥后得到3.00g二醛官能化聚乙二醇（DF-PEG），产率79.8%。支持信息中描述了单官能化聚乙二醇（MF-PEG）的合成和表征（图S1）。1H NMR (300 MHz, CDCl3, delta;): 10.10 (s, 2H, CHO), 8.22 (d, J = 8.3 Hz, 4H, CHCCHO), 7.96 (d, J = 8.3 Hz, 4H, CHCHCCHO), 4.52-4.49 (m, 4H, COOCH2), 3.86-3.83 (m, 4H, COOCH2CH2), 3.69-3.58(m,172-176H,OCH2CH2O)。IR(KBr):nu;(cm-1) =3490, 2882, 1976, 1717, 1466, 1345, 1280, 1104, 961, 842。

3.2水凝胶的制备。在2.1%（w/w）的醋酸水溶液中溶解一定数量的壳聚糖，制备3%（质量比）壳聚糖溶液。将1.0g聚合物溶于4.0g蒸馏去离子水中，得到20%（w/w）DF-PEG溶液。作为一种典型的水凝胶制备，将DF-PEG溶液（0.25ml）于20℃加入壳聚糖溶液（0.70g）中。在涡流的作用下，30-40秒内发生凝胶化。（参见支持信息中的视频。）用PEG和MF-PEG作为对照，在相同条件下与壳聚糖溶液混合，未观察到凝胶形成（支持信息，图S2）。

所有其他分析用凝胶的制备方法相同。所有%浓度的溶液均按质量（w/w）给出。含罗丹明B或溶菌酶的水凝胶在20℃培养6h后进行控释实验。

3.3流变学试验。采用不同的DF-PEG/壳聚糖配比制备了一系列水凝胶，以测试其力学性能。作为一个典型的操作，壳聚糖溶液（0.70 g，3%醋酸水溶液）铺在平行板上（直径：40mm）。将DF-PEG水溶液（0.27 g，20%）均匀滴入壳聚糖溶液表面。储能模量Grsquo;和损耗模量G”作为时间的函数进行测量（图2a）。对于模量值与频率的关系分析，采用相同方法制备样品，在37℃下培养40分钟，然后进行数据采集（图2b）。

3.4自修复实验。1）用上述方法制备了两个水凝胶圆盘，其中一个圆盘中加入微量罗丹明B，以产生颜色差异。这些水凝胶被切成两块，两个不同颜色的半圆被放在一起形成一个联合圆盘。在联合凝胶中间打一个直径为0.9cm的孔，以不同的时间间隔拍摄照片，记录联合凝胶的外观。作为对照，将热明胶水溶液（5%）冷却形成水凝胶盘（图3）。

2）通过流变学分析对自修复过程进行定性监测。简言之，制备如上所述的凝胶（固体百分比：3.8，CHO/NH2:0.055），并测试储能模量Grsquo;（sim;1150pa，图4a）。随后将凝胶切成16片放在平板上，记录Grsquo;值与凝胶破裂时间的关系（图4b）。同时还进行了Grsquo;与剪切应力的对比，当应变（gamma;）ge;100%时，凝胶的Grsquo;迅速下降。因此，随后对不同振幅的Grsquo;值进行了测试。在相同频率（1.0Hz）下，振幅振荡力从gamma;=200%变化到20%，以测试水凝胶力学性能的恢复，并重复该过程两次。

3.5多响应分析。水凝胶（0.45 g，固体百分比：6.0；CHO/NH2:0.36）对水（1.0 ml）、维生素B6衍生物（PL-HCl，1.0 ml，50 mg/ml）、氨基酸（赖氨酸，1.0 ml，100 mg/ml）和酶（木瓜蛋白酶，1.0 ml，50 mg/ml）溶液的响应进行了测试，并显示在支持信息中（图S5和S6）。选择pH值变化作为典型刺激，描述如下：如上所述，将3%壳聚糖溶液（0.70g）和DF-PEG（250mu;l，0.27g）混合制备水凝胶，加入微量罗丹明B以便更好地观察。将浓盐酸水溶液（60mu;l，6 mol/L）加入水凝胶中，在5min内用涡流将水凝胶液化。随后加入浓NaOH水溶液(60mu;L, 6 M),中和酸，水凝胶在60秒内再生.这个过程在我们的实验中至少可以重复6次，并且水凝胶仍然可以再生（图5）。

3.6罗丹明B的可控释放。将壳聚糖溶液（0.33g，2.5%醋酸水溶液）、DF-PEG溶液（100mu;l，0.12g，20%）和罗丹明 B水溶液（5mu;l，1.0 mg/ml）在涡流中混合约30-40s，制备4个水凝胶装入4个小瓶中。将水凝胶在20℃下培养6h，然后将4种不同的刺激物，即纯水（1.0ml）、溶菌酶（50mg/ml、1.0ml）、木瓜蛋白酶（50mg/ml、1.0ml）和盐酸吡哆醛中性溶液（PL-HCl、50mg/ml、1.0ml）分别加入4个小瓶中。将壳聚糖（0.33 g，2.5%醋酸水溶液）、纯水（100mu;l 1.0 ml）和罗丹明 B水溶液（5mu;l，1.0 mg/ml）混合制备对照溶液，对照溶液在紫外光555 nm处的吸光度定义为100%。我们每30分钟取出100mu;L的样品溶液，在555 nm处进行紫外分析，然后将其放回系统中。在取样前，用涡流摇动混合物5-10 s，并拍照（图6），使用SPSS 15.0进行统计数据分析。

3.7溶菌酶生物活性分析。将乙酸、壳聚糖、DF-PEG、PL-HCl和木瓜蛋白酶与溶菌酶混合，检测其对蛋白质生物活性的影响。在支持信息中列出了混合不同化合物的溶菌酶溶液（表S1）。由于溶菌酶可以通过催化N-乙酰氨基葡萄糖与N-乙酰胞壁酸之间的1,4-beta;键的水解而破坏细菌细胞壁，导致细菌裂解，因此将溶壁微球菌(Ml)细胞作为底物用于检测该蛋白质的生物活性。以溶菌酶水溶液（支持信息，表S1，样本6）为对照。选择溶菌酶-壳聚糖溶液（支持信息，表s1，样本1）作为典型的蛋白质生物活性分析，操作如下：

溶菌酶-壳聚糖混合物(2mu;l)用PBS (pH 6.5,100 mmol/L)溶液稀释至200mu;l。然后，将稀释液（6mu;l）与Ml细胞悬液（1.0mg/ml，194mu;l）混合，每隔10s记录450nm处的吸光度，持续3min。根据以下方程计算活性： A（单位/ml）=-K/（0.001 V D），其中A为相对溶菌酶活性，K为曲线斜率，V为样品溶液体积（mL），D为稀释系数。用相同的方法测试溶菌酶在水溶液中的相对生物活性（支持信息，表S1，样品6），定义为100%。不同化合物的相对溶菌酶生物活性结果如图7a所示。

3.8溶菌酶的释放。在水凝胶体系中加入溶菌酶，以Ml细胞为底物检测释放蛋白质的生物活性。溶菌酶在各种刺激下的释放过程如下。将壳聚糖溶液（100mu;l，3%醋酸溶液）、溶菌酶水溶液（100mu;l，50mg/ml）和DF-PEG水溶液（50mu;l，20%）均匀混合在一起，分别制备了两个水凝胶。20℃下培养6小时后，两个水凝胶分别加入PL-HCl (0.5 ml, 50 mg/ml)和木瓜蛋白酶(0.5 ml, 50 mg/ml)溶液。混合物保存在恒温摇动器中(300 r/min, 37C)。每隔一定时间取样，用上述相同的方法对释放蛋白质进行生物活性分析。采用SPSS15.0进行数据统计分析。分别以壳聚糖/溶菌酶溶液和木瓜蛋白酶/溶菌酶溶液作为对照，测定溶菌酶在水溶液中的生物活性定义为100%(图7b)。

4. 结果与讨论

4.1聚合物的合成。以羟基取代聚乙二醇（PEG）与4-甲酰基苯甲酸酯化反应制备了二苯甲醛官能化聚合物（DF-PEG）。在DF-PEG的1H NMR谱图(图1a)中，聚合物主链上的醚亚甲基质子给出了3.64 ppm的信号，并分别清晰地观察到与醛(10.10 ppm)、苯环(8.22 ppm)、酯亚甲基(4.51 ppm)基团相对应的新峰。8.22、7.96、4.51和3.64的积分比为4/4/4/181，

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