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草莓果实中糖酸相关的品质及酶活性的研究：蔗糖酶是主要的蔗糖水解酶
C.E. Basson, J-H. Groenewald , J. Kossmann, C. Cronjeacute;, R. Bauer
摘要：本文介绍了Festival和Ventana这两个品种在连续四个发育阶段的糖和有机酸的含量组成，这是草莓品质的主要决定因素。这两个品种的代谢物特征非常相似。葡萄糖是主要的糖，是果糖和蔗糖浓度的两倍，成熟果实中总酸浓度比总糖浓度低5倍，柠檬酸大约占总酸量的三分之二。在果实发育过程的相关代谢途径中关键酶的最大可提取催化活性被量化，试图阐明可能的相关性。蔗糖合成酶活性非常低或未被检测到，而中性转化酶活性相对较高，这表明蔗糖合酶对这些栽培品种的下沉强度没有显着贡献。转化酶、焦磷酸依赖性磷酸果糖激酶（PFP）和果糖-1,6-二磷酸酶（FBPase）在发育过程中表现出明显的活性变化，并且可能影响草莓的糖酸积累以及糖分组成。
关键词：果糖-1,6-二磷酸酶、蔗糖、焦磷酸依赖性磷酸果糖激酶、Festival、Ventana、水果质量、代谢产物
1、介绍
草莓（Fragaria x ananassa）的品质在很大程度上由所含的糖和有机酸的相对量决定。草莓的代谢组成一直是许多人关注的研究焦点，主要研究其营养、味道（糖和有机酸含量，特别是抗坏血酸含量）、果实颜色（花青素）和软化的经济重要性。最近，草莓已经成为科学研究的模板，用来分析研究其非跃变型果实代谢和转录谱（Folta＆Dhingra，2006）。由于其生长周期短，而且体积小，草莓已作为一个研究葡萄浆果的模型系统被提出（Burger，2000）。
与已知商业成功的品种相比，草莓甜度通常由一组受过训练的食物品尝者评估，如Camarosa。感官评估很大程度上受到成熟果实中糖和酸的相对量和总量的影响（Darbellay，Carlen,Azodanlou，＆Villettaz，2002）。甜度只是草莓商业成长中可取的特征之一，其他还包括鲜红色，光泽的果实，整个生长季节高产量，大型且形状良好的果实，坚定并耐受生物胁迫。最低和首选的Brix指数通常用来评估果实的成熟度和质量，Brix通过分析制浆和过滤来确定果实组织并给出总可溶性固体（TSS）的标示。多年来，在繁殖期间，甜度并不是最主要的问题， TSS往往受到果实大小或产量增加的不利影响（Faedi，Mourgues，＆Rosati，2002），结果是商业栽培品种在代谢物中表现出很大的变化。
具体而言那些与水果质量相关的参数，更改代谢物的浓度是公认的作物改良目标。分子方法通常针对特定的在成熟过程中有活性的生物合成途径（Park，2006）。在浆果成熟过程中，草莓积累的糖和有机酸，主要是柠檬酸和苹果酸（Montero，Mollaacute;，Esteban，＆Loacute;pez-Andreacute;u，1996; Meacute;nager，Jost，＆Aubert，2004）。在大多数植物中，蔗糖是来自光合作用源组织的主要进口碳水化合物，主要是叶片。蔗糖积累受碳水化合物库强度的影响，将其定义为在生物合成和呼吸过程中，光合产物由库细胞积累使用的速度（Doehlert，1993）。库强度受蔗糖从细胞质中通过酶降解或转运到液泡储存的去除率影响（Kruger，1998）。根据沉淀物组织的类型，蔗糖通过蔗糖合成酶（SuSy；NDP-葡萄糖：D-果糖2-alpha;-D-葡糖基转移酶EC2.4.1.13）或转化酶（beta;-呋喃果糖苷酶，EC 3.2.1.26）降解。这些酶的活性通过保持韧皮部和汇细胞之间的浓度梯度而影响库强度（Taiz＆Zeiger，2002）。复杂的反应网络即用蔗糖降解产物，将它们导入碳库，例如糖、有机酸、碳水化合物和氨基酸。碳是动态的，它们对碳水化合物总量的相对贡献可能会根据内部因素而改变，例如发展阶段和外部影响。反应速度确定每个池的大小并间接影响转化酶和蔗糖合成酶活性的变化，抑制其催化活性或活性代谢物的浓度。
本文研究了Festival和Ventana这两种在南非广泛种植的草莓代谢组成。在佛罗里达州的温带气候下，Festival品种的草莓具有外形美观的大果实，长途运输中不易腐烂（Chandler，Legard，Dunigan，Crocker，＆Sims，2000），该品种是商业品种罗斯和奥索格兰德的杂交。Ventana是通过两个非商业性的交叉品种，生长在加利福尼亚南部的干旱亚热带地区，该品种作为加利福尼亚大学育种计划的一部分（Larso＆Shaw，2003）。Festival和Ventana这两个品种的草莓在果实颜色、硬度、甜度、产量和对白粉病的耐受性等方面相似（Chandler，2000; Larson＆Shaw，2003）。
本研究旨在通过对南非这两个流行的草莓品种的糖和有机酸组成进行测定，有助于现有的甜度等品质参数的测定。不同于以前那些分析的品种，本文对Festival和Ventana的代谢物组成和质量特性进行了评估。本文还研究了蔗糖代谢和糖酵解过程中可能影响总糖和酸含量的一系列酶以及甜度和酸度之间的平衡。
2、材料和方法
2.1 材料
实验所用材料是2007年9月在南非帕尔的洛文收获的Festival和Ventana两个品种的草莓。根据视觉标准从四个发展阶段的相邻田间收获草莓果实，每个发育阶段大约收集了20颗草莓，随机分成三个重复并用液氮中冷冻，将保存于-80℃直到进一步分析。
除抗坏血酸氧化酶（Sigma，St.Louis，MO）外，其他所有酶都购自Roche Diagnostics GmbH（Mannheim，德国）。所有其他试剂都是分析级的，从Sigma，Roche或Merck（Whitehouse Station，NJ）购买的。
2.2 生化分析
2.2.1 蛋白质提取和酶活性测定
由于草莓酸性强，蛋白质含量极低（Bianco等，2009），需要适应现有的蛋白提取方法以确保可接受的产量。草莓被磨碎放入液氮中和300mM Hepes-KOH缓冲液中提取的蛋白质，缓冲液成分包括有2mM MgCl 2，2mM EDTA，10％（v / v）甘油，2.5％（v / v）PEG 6000,0.05％（v / v）Triton X-100,5mMDTT，2％（m / v）PVPP和1mM PMSF。样品使用Sephadex G25离心柱（Helmerhorst＆Stokes，1980）进行脱盐处理和用量化牛血清白蛋白作为标准（Bradford，1976）并使用Bio-Rad蛋白质分析器（Hercules，CA）进行蛋白质分析。酶的检测如前面所述，如表1所示。所有反应均在340nm处的微孔板分光光度计上，用KC4 Kineticalc的2.7版本的Windows监控。
表1 酶活性分析
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酶 |
无起始底物的成分分析 |
底物 |
参考 |
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AGPase |
40mM缓冲液（PH 7.5），4mM MgCl2, 0.8mM NADP , 0.2 mg/mL BSA，1mM ADP-glucose，1U GDH, 1U PGM |
1mM PPi |
Rocher, Prioul, Lecharny, Reyss, amp; Joussaume, 1989 |
|
FBPase |
50mM缓冲液(pH 7.2), 5mM MgCl2, 0.5mM NADP , 2U PGI, 1U GDH |
0.6mM F16bP |
Kruger amp; Beevers, 1984 |
|
GDH |
50mM缓冲液(pH 7.2), 5mM MgCl2, 0.5mM NADP |
1mM G6P |
Doehlert, Kuo, amp; Felker, 1988 |
|
HK |
50mM缓冲液 (pH 8.0), 4mM MgCl2, 2mM glucose, 0.5mM NADP , 1UGDH |
2.5mM ATP |
Doehlert et al., 1988 |
|
Invertase |
100mM缓冲液(pH 7), 200mM sucrose, 10mM MgCl2, 0.8mM NAD,1U GDH, 1U HK, 1U PGI |
1mM ATP |
Schaarschmidt, Qu, Strack, Sonnewald, amp; Hause, 2004 |
|
PEPc |
100mM Tris (pH 8.5), 4mM MgCl2, 6mM NaHCO3, 0.3mM NADH and 5U MDH |
5mM PEP |
Ocantilde;a, Cordovilla, Ligero, amp; Lluch, 1996 |
|
PFK |
100mM缓冲液(pH 7.2), 2mM MgCl2, 0.15mM NADH, 1mM ATP, 1Ualdolase, 10U TPI, 1U GPD |
10mM F6P |
Burrell et al., 1994 |
|
PFP |
50mM缓冲液(pH 7.2), 2mM MgCl2, 1mM PPi, 0.15mM NADH,0.01mM F26bP, 1U aldolase, 10U TPI, 1U GPD |
10mM F6P |
Botha amp; Botha, 1990 |
|
PGI |
100mM Tris (pH 7.0), 5mM MgCl2, 0.5mM NADP , 10mM F6P, 1UGDH |
10mM F6P |
Doehlert et al., 1988 |
|
PK |
50mM Tris (pH 7.0), 100mM KCl, 15mM MgCl2, 0.15mM NADH,1mM ADP, 2U LDH |
5mM PEP |
Burrell et al., 1994 |
|
SuSy |
100mM缓冲液(pH 7.5), 15mM MgCl2, 0.2mM NADH, 20mM UDPglucose, 1mM PEP, 1U PK, 1U LDH |
10mM fructose |
Schauml;fer, Rohwer, amp; Botha, 2004 |
|
UGPase |
100mM Tris (pH 7.0), 2mM MgCl2, 0.5mM NADP , 12mM UDPglucose,1U GDH, 1U PGM |
1mM PPi |
Doehlert et al., 1988 |
- AGPase，ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（EC 2.7.7.27）；FBPase，果糖-1,6 -二磷酸酶（EC 3.1.3.11）；GDH，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（EC 1.1.1.49）；HK，己糖激酶（EC 2.7.1.1）；蔗糖酶、beta;-fructosidase（EC 3.2.1.26）；PEPc，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（EC 4.1.1.31）；磷酸果糖激酶，磷酸果糖激酶（EC 2.7.1.11）；PFP,磷酸果糖激酶（EC 2.7.1.90）；PGI、磷酸葡萄糖异构酶（EC 5.3.1.9）；PK，丙酮酸激酶（EC 2.7.1.40）；SuSy，UDP-葡萄糖：D-fructose，2-alpha;-D-glucosyltransferase（EC 2.4.1.13）；UGPase、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶（EC 2.7.7.9）。
- 醛缩酶、果糖-1,6-二磷酸醛缩酶（EC 4.1.2.13）；F26BP，果糖-1,6 -二磷酸；F6P，果糖6磷酸；GPD，3-磷酸甘油脱氢酶（EC 1.1.2.8）；乳酸脱氢酶、乳酸脱氢酶（EC 1.1.1.27）；MDH、L-苹果酸脱氢酶（EC 1.1.1.37）；PEP，磷酸烯醇式丙酮酸；PGM、葡萄糖磷酸变位酶（EC 2.7.5.1）；PPI，焦磷酸钠（na2p4o7）；TPI，磷酸丙糖异构酶（EC 5.3.1.1）。
- F16BP，1,6-二磷酸果糖；G6P，葡萄糖-6-磷酸。
2.2.2 代谢物提取和定量
将从地面提取可溶性糖和有机酸果实组织放置于过夜温在70℃的
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