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利用农田规模的英国饲用玉米（Zea mays L.）研究作物与作物之间的基因流
摘要：从2000到2003范围内的农场规模评价（FSE）试验是在英国建立用来评估耕地有杂草和无脊椎动物，抗除草剂的释放和管理效果（HT）。玉米FSE试验也被用于研究作物和作物之间基因漂流和发展的基因漂流频率的预测，可以用来评估转基因作物目前距离准则的统计模型。从55个试验地点的非转基因一半的种子样本中，1055个被测试的证据是用HT（PAT）基因定量PCR技术从转基因HT半基因流中获得的证据。随着转基因源距离的增加，基因漂流率迅速下降。在GM来源的150米（40个）中，有30%的样本检测到基因漂流，在GM距离的距离和包括转基因源的200米处检测到了GM到非转基因基因漂流的事件。定量的数据进行统计分析，为提供最适合的数据，发现了一个两个步骤的模型，。一个动态的全场模型预测，一个正方形的字段（150米·150米）的谷物玉米将需要一个3米的分离距离为相邻作物低于0.9%阈值（以2%的概率超过阈值）。文中给出的数据和模型在必要的分离距离的范围内讨论，以实现玉米中不定存在GM的各种可能的阈值。
关键词 基因流 转基因作物 抗除草剂 实时荧光定量PCR 饲料 玉米
介绍
自20世纪90年代中期以来，全球范围内转基因玉米的数量稳步增长，现在已经占全球玉米面积的14%（James，2005）。在欧盟，玉米是唯一的商业转基因作物，特别是西班牙，在2003年有32000公顷（占玉米总面积的7%）被用来种植转基因玉米 (Brookes et al. 2004)。从2000年到2003年，农场规模评估（FSEs）是为了评估抗除草剂的释放和管理效果（GM HT）对农田作物的耕地杂草和野生动物（无脊椎动物相比与传统的丰富性和多样性（非转基因）作物的影响。结合这些试验, 还委托对转基因作物的基因流动进行研究, 利用冬季和春季油菜 (OSR) 和饲用玉米的 FSE 地点, 对除草剂膦铵进行转基因耐受。FSEs 不是专门设计来评估基因流的, 因此它们没有在GM和非GM的一半之间引入可变的分离距离。尽管有这个缺点，但它们代表了迄今为止在一项研究中分析最多的站点（55）和样本（1055），为研究可能发生的基因流范围提供了极好的机会。
作物与作物之间的基因流动的研究是重要的，因为它和种子不纯一样是主要的因素可能导致不定存在的转基因材料在传统或有机玉米作物中。不定存在是互惠的, 不是转基因作物本身的功能。虽然在这项研究中基因流动可以通过花粉散布或种子棚发生,但因为野生玉米不能在英国生存和并且以前没有种植过转基因玉米, 唯一的机制是花粉传播。玉米具有高的异交结实率 (只有5%的自交结实发生), 其花粉是风分散的, 这两种因素赋予了相对较高的基因流 (Hamrick 和 Godt 1997)。花粉粒比其他风媒授粉种大, 玉米花粉迅速沉淀到地面, 其中大部分落在距离花粉源的60米以内(Raynor et al. 1972)。授粉率受环境条件 (风速和方向、表面湍流、温度和湿度)、施主和受体地块中花粉的相对浓度、自水平和密度的影响(Emberlin 1999) 和开花同步性 (海尔和 al. 2005)。通过种子棚散播种子在英国一般不被认为是一个问题, 因为大多数的玉米种植在英国是用于青贮 (收获未成熟和用作牛饲料)。
关于花粉的基因流动，仅有有限的文献可供利用。异交结实率报告的范围从40% 在 2.5 m (Bateman 1947), 4.5% 在 3 m (Jugenheimer 1976), 1.11% 在 200 m(Burris 2001)和2.47% 在 200 m (Jones and Brookes 1950)。以往关于玉米基因流动的研究尚未在商业规模上进行（Burris 2001除外）。在英国，FSE试验提供了一个机会，在许多地点和环境中取样大量的领域。
花粉介导的基因流动可以通过种植转基因作物与非转基因邻居的最小隔离距离来调节。《农产品供应链倡议》1(SCIMAC)已经确定了转基因作物和传统作物的隔离距离(SCIMAC 1999)。要求的抗除草剂转基因米与饲料作物的最小的建议隔离距离是80米，与甜玉米的最小建议隔离距离是200米。标准玉米种子作物和注册的有机作物与转基因作物的建议隔离距离是200米。(SCIMAC 1999)。
欧盟的转基因产品的发布、营销和适当标签由指令2001/18／欧共体和条例1830/2003和1829/2003控制。对于在食品和饲料中的不定的 GM 存在, 一般的标签门槛已经设定为0.9%。在常规种子库存中, GM 存在的特定阈值尚未确定。英在英国，关于转基因和有机作物共存的争论往往集中在0.1%的一个可能阈值。对已使用的分离距离的审查来满足特定阈值的审查(Ingram 2000)，目的是激发现有的科学关于分离距离与作物纯度水平关系的认识。Ingram (2000)的结论是对于传统的玉米品种, 1.0% 阈值所需的距离为80米, 0.1% 的距离需要为290米。
本研究的目的是探讨在整个英国的 FSE站点中, 从GM源作物到200米的花粉介导的基因流 (%表示为GM DNA), 利用这些数据来评估从FSEs的基因流评估得出的假设, 并评估 SCIMAC 颁布的指导方针是否有效。
材料和方法
采样方法
FSE 玉米地由一个分裂的区域设计组成。其中一半区域被播种了与自由链接 tm, 线 T25 (包含 pat 基因), 它可以忍受自由 tm, 宽广的光谱, 无残留 膦铵除草剂而另一半区域播种常规玉米品种。FSE 在英格兰和苏格兰的许多地方和环境中取样了大量的地点。这些站点在全国各地分布良好, 大部分的研究站点的大小范围都小于10公顷(Champion et al. 2003), 宽度从100米到400米 (平均250米) 不等。在3年期间, 共有1055样本从55地点收集和测试。3年中，在常规作物的6个断面上采集谷物样品。每个样本由3-5 棒子 (gt; 1000 种子) 组成, 每一个都从同一排中的植物采集的取样位置中分离出来 (沿1米的距离, 垂直于横断面的线, 与 GM 源等距)。
沿每个横断面, 在下列距离收集谷物样本 (m): 2, 5, 10, 20 或 25, 50 和150米 (在4米的玉米站点样本也采取了在 200 m) 远离与转基因作物的交界处。如果场地长度太短, 不能有150米取样点, 则在5米的农田边缘 (距离转基因作物最远的边缘) 和所注明的距离收集种子。
DNA提取和实时PCR
玉米粒从棒子和地面上移除, 用商业食品搅拌机将其磨成细面粉。使用Promega Wizard Magnetic DNA提纯系统和Labsystems KingFisher ml Magnetic Particle Processor提取基因组 DNA。
用 real-time (TaqMan) 聚合酶链反应 (PCR) 对玉米样品进行了重复试验。使用了两套引物和探针。一组特定的 pat 基因编码膦乙酰 (目标基因用于检测 T25 转化事件; 向前, 5-CTGTCCAATCGTAAGCGTTCC-3cent;; reverse,5cent;-GGTGTTGTGGCTGGTATTGCT-3cent;; probe,5cent;-FAM TMAGCCTTCCAGGGCCCAGCGT-TAMRA TM-3cent;);另一组则是特定于 Z. cdc2 基因 (前、5-TGTACAAGGCGCTGGACAAG-3cent;; reverse,5cent;-GCTCGAGGCGGATCTTCTT-3cent;,5CCACCAACGAGACGATCGCGCT) TAMRA-3cent;) (Ren et al. 1997)。内源性对照引物有两个目的。首先, 说明 每个样本的DNA 提取和 PCR 是否成功； 第二，作为一个标准化程序(一致的副本编号参考), 使每个样本中相对数量的 GM 可以量化。
从 GM 阳性对照材料中提取的已知数量的 DNA 制备的样品使用标准曲线进行量化。安万特 (现拜耳作物) 提供了 T25 玉米种子的阳性对照材料。T25 杂交玉米作为100% 参考物质, 即%GM 生物体, 而不是%GM 基因组。目前欧盟指导通用量化阈值的规定，单位应为转基因DNA在监管和指导1829:2003 1830:2003定义（欧洲委员会，2004）。因此, 在建模之前,%GM 生物体的测量被转化为%GM DNA, 乘以 0.58, 这是 F1 玉米籽粒中 GM DNA含量的近似因子, 用作 100% 的校准(Papazova et al. 2005)。标准曲线是通过绘制已知的混合基因组DNA标准的 C T (阈值周期) 值, 以对数10的基因组 GM DNA(块和施瓦茨 2003) 的日志来创建的。然后用标准曲线计算未知样品的数据。通过内源控制计算出转基因目标的数量，乘以0.58，获得了DNA。
玉米基因流与分离距离的模拟
为了估计预期的基因流量在指定的距离, 从玉米转基因源建立一个统计模型, 以适应观察 FSE 基因流量数据。使用196场样, 包括零值, 没有单一的概率密度函数可以找到适合观测值的所有样条距离。采用两步法适用以前的数据为OSR (Weekes et al. 2005), 但是，发现了统计分布和参数拟合 (图 1)。第一步是一个给定的样本将包含任何 gm (1-y) 的概率, 其中 y 是概率为零 gm 在指定的距离, x。这一步被认为是最好由一个二阶对数方程来描述(Eq 1: y 0 = 0.0158; a = 0.0671; b = 0.0127;R 2 = 0.986)。
第二步，在样本中发现GM，它的期望概率密度函数（PDF）在那个距离。最好的拟合PDF被发现是贝塔分布 (Pearson and Johnson 1968)。beta;分布的形状, 即扩散和平均值, 由两个参数, m 和 x 描述。参数 m, 是恒定的与距离 (m = 0.524, r = 0.08)。该参数, x, 拟合一个二阶对数曲线与距离的相同形式的 Eq. 1参数: y 0 = 12.86;a = –7.8;b = 7.96;R 2 = 0.997。beta 分布的平均值由: (m/(m x)) (Pearson and Johnson 1968)。在给定的距离上, GM (m) 的预期平均比例是由第二步 (Eq 2) 乘以一步计算得出的。
图1（a）样本中零GM的观察概率与GM源距离的图。（b）所有正GM值与距离的拟合beta;分布x形状参数图。这两条曲线都是距离的二阶自然对数。
为了获得整个场均值的GM DNA的估计值，给定GM源的指定距离，采用动态场模型如下。用上述两步模型模拟了等间距采样点的正方形场。最接近的场边缘到GM源的距离随后递增。在每一个分离距离增加的情况下，计算出平均% GM DNA。每个字段的第九十八个百分位数是从模拟的每个模拟场的分布中计算出来的。记录了第九十八个百分位数不超过指定阈值的分离距离。整个场模型随着正方形场大小的增加而重复，从50·50 m到500·500 m，在每一种情况下，GM源沿正方形的一个整体。与GM源边缘平行或正交的细长形状的场将表现出非常不同的特性。为了简单起见，我们只给出了增加正方形场大小的结果。
结果与讨论
FSE试验建立研究除草剂和传统农业的做法并没有明确确定的基因流动的程度与生物多样性的影响。因此，数据仅限于转基因作物领域200米的距离，而分离物总是含有生长的作物。然而，这些试验使我们能够比以往的研究更有信心地估计现实耕作方式下基因流动的潜力。（正如Ingram 2000; Brookes et al. 2004回顾）。
图2在所有玉米 FSE 样本与距离之间测量的%GM DNA 的图形。虚线显示上第九十八百分位和实线为拟合 two-step 模型的平均值
这项研究的结果表明，GM与非转基因基因流的频率随着GM源距离的增加而迅速下降（图2）。在非转基因基因流的距离和包括转基因源的200米处检测到转基因事件。在与转基因作物相邻的样本（0 - 2米）中，基因流的最大水平为60%，平均值为4.8%。表1提供了在每个距离收集的原始数据摘要。
用二次对数曲线较好地描述了GM距离与GM源距离的概率增加。三个距离，15米, 40米和200米，少于30个样品。（包括零），被排除在模型拟合中。在这些距离上的样本量较小（分别为18, 6和21），与其他距离的gt; 60相比，见表1）从最佳拟合曲线贡献不成比例的变化。在每个距离上非零GM值的分布最好用贝塔分布来描述。两个模型步骤的曲线如图1所示。请注意，在较大的距离（100米），贝塔分布不适用。由于缺乏非零值的数据，因此不能估计x。然而，在这些距离较大的情况下，零GM的概率成为数据中最主要的特征。图2显示了原始数据和第九十八个百分位数（1000个重复模拟）使用两步模型估计的DNA与距离的关系图。
表1从 GM 作物的距离 (m) 中收集的数据的汇总, 包括平均%GM DNA、最大%GM DNA (在该距离的一个取样点检测到)、阴性样本数和每个样本的总数距离
斜体的数字被排除在模型之外。
我们确定了收割作物的总GM含量低于四个不同阈值（0.9、0.5、0.3和0.1%）的最小分离距离，基于上述动态领域情景的第九十八个百分位数估计值。GM源和非GM字段之间的不同字段大小被合并为一个平方非通用字段，GM源沿一个长度的长度。如果GM基因流来自多个源域，那么我们期望基因流和分离距离要比每个GM源的每个距离的模型函数的总和
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