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在玉米地内部和外部玉米花粉在植物叶片上的沉积
摘要
已有一些在不同地区开展的研究测量了在玉米内部和外部的乳草属植物叶片上的玉米花粉浓度。做这些研究的目的是为了获得有代表性的自然条件下的玉米花粉浓度，以此来为实验室和农田中对黒脉金斑蝶幼虫啃食带有玉米花粉的乳草属植物叶片的研究提供参考。在玉米地中花粉浓度最高（平均为170.6粒/cm2），从玉米地边缘向外围逐渐降低，在距玉米地2m处降低为14.2粒/cm2。在玉米地中，距离玉米地边缘的不同距离上，得出关于不同花粉浓度叶片样本的比例的频率分布。在玉米地中，95%的叶片样本的花粉浓度低于600粒/cm2，，最高的花粉浓度观测值是1400粒/ cm2，该观测值出现在无雨的开花期，其他研究中开花期均有降水天气。一次单独的降水过程可以消除叶片上54-86%的花粉。黒脉金斑蝶偏爱吃乳草属植物上部的叶片，这部分叶片上的花粉浓度只有植物中部叶片上的30-50%。
为了准确地解释研究得出的Bt玉米花粉对黒脉金斑蝶幼虫的影响，需要知道自然条件下乳草属植物叶片上花粉浓度的范围和分布。这会同时为实验室条件和大田条件下黒脉金斑蝶幼虫吃带有Bt玉米花粉的乳草属植物叶片研究提供参考数据（1,2）。我们需要确定在试验中观测花粉浓度特征的频率。这些研究为分析Bt玉米花粉对黒脉金斑蝶的危害提供必要的花粉特征依据。这篇报告的特别之处在于介绍了在不同地理区域中不同环境条件下，开花期时乳草属植物叶片上玉米花粉的浓度。因为玉米花粉在有风的情况下至少可以扩散60m（3），有时扩散范围会超过200m（4），所以我们分析了玉米地及周围区域在乳草属植物叶片上的玉米花粉浓度。一篇文献中（5），实验室得到食用玉米花粉浓度不同的乳草属植物叶片的黒脉金斑蝶幼虫的生理状况，实测数据配合实验室数据进行使用。这些数据也可以为第二篇文献（6）中人工控制黒脉金斑蝶幼虫食用的乳草属植物叶片上的Bt玉米花粉浓度提供框架性的指导。最后，这些数据被用在了一个概述性文献中，全面进行黒脉金斑蝶和Bt玉米花粉的风险评估。除了表征自然状态下的花粉密度，我们分析了影响叶片表面花粉密度的因素，包括叶片在植株中的位置和降水天气。
材料和方法
这篇文献包括了几个在不同地区进行的研究的结果。研究的地区为Iowa, Minnesota, Wisconsin，Ontario (Canada)和Maryland，这些是东部黒脉金斑蝶活动区域的典型地区。一般来说，使用的方法包括测量累积在乳草属植物叶片(Asclepias syriaca)上的来自玉米地的玉米花粉（大部分为非Bt），或者用如移植的植物、盆栽或植物的茎代替天然的植物。这些研究也在玉米田内、玉米田外或两个区域都进行了在乳草属植物叶片上花粉沉积的测量。乳草属植物的横断面与玉米地的边缘交界，玉米地的边缘定义为0m，玉米地内部的位置定义为负数，玉米地外部的位置定义为正数。植物叶片的样本采集在开花期中、开花期结束时或两者都进行。开花期的确定由计算抽样中玉米穗中开花散粉的部分占的比例来进行。一些研究用粘滑的平板或切片来测量空气中花粉浓度水平。
马里兰州（Maryland）1999年进行的玉米地内和玉米地外的花粉沉降研究。在两个东岸地区和四个中部地区，从玉米地内和玉米地外，在距离玉米地不同距离的572棵乳草属植物上共摘取1317片叶片。在玉米进入开花期后的7月14日至7月24日进行了样本采集，在这期间采样地区没有降水天气。对于较大的植株，叶片从上部、中部和底部进行取样，较小植株只在顶部取样。叶片保存在保鲜袋中运送至实验室。通过使用含有表面活性剂的清水冲洗和用小软刷涂刷，去除叶片上的花粉。保鲜袋也需要冲洗。在一些情况下，通过冲洗可以过滤花粉，再将过滤纸沥干保存。过滤或冲洗的样本被送至位于德州卡城（College Station,TX）的美国农业部农业研究服务花粉实验室（the U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service Pollen Laboratory），根据Erdtman(8) 、 Jones 、Coppedge (9)的描述进行样品处理和花粉研究。用李肺叶面积仪(Li-Cor, Lincoln, NE)测量测量叶片面积，对于每片叶片，通过花粉数除以叶片面积得出花粉浓度。
马里兰州，2000。这项研究是在贝尔茨维尔的马里兰大学的研究和教育中心的一个8公顷的麦田（the University of Maryland Research and Education Center at Beltsville, MD），周围是低矮的草地。在玉米开花期（10天）前，已经移植在玉米地内和玉米地外，沿着两侧在四个方向上的植物根茎，一植株被分别移植在距离各边线-10，-5，-3，-1,1,3,5,10m处，在玉米地内部的植株被种植成行，并在距离边线-10，-5m处行中安排额外的植株，与行列中的植株距离不超过2m，玉米种植间隔为0.76m。
在开花期到来的第3、6、9天分别摘取在各个植株上三分之一出的一片叶片，在14天后，分别从上部、中部和下部摘取叶片。叶片要立即送至实验室中并且直立放置在一个15厘米的培养皿，覆盖湿润的滤纸。用# 3软木刀在每片叶片上做出轻微凹陷，描述叶片中脉和边缘的0.34cm2区域的状态（在第14天的这两个区域），在立体显微镜下完成观察区域的花粉颗粒数目计数。
Ontario, 2000。在叶片上的密度和在粘板上的密度的比较在三块Bt玉米地和三块非Bt玉米地中进行比较，试验地位于加拿大安大略中南部惠林顿。试验范围从4.8-17.2公顷，每片试验地的选择都要求距离玉米地至少150m，一次来减小花粉污染。在每块试验田中，垂直试验田一个或两个边界做四个横断，在同一块试验田中平行的横断间隔40-180m。沿着每个横断，盆栽乳草属植物和粘板放置在距离试验田边缘-1m，5m，0m，1m，5m处。 粘板是由粘性材料涂覆的皮氏培养皿制成(Sticky Stuff, Olson Products, Medina,OH)。粘板水平放置在1m高的木桩顶部。在开花期开始的前几天，粘板和植株就要放置在试验田中。在开花期开始后，粘板要连续16天每天更换，在开花期第6和第11天收集各个试验田的叶片。叶片分别从每株植株的上部、中部和下部收集。每一片叶子立即被夹在两条接触纸(ConTact7 Brand, Decora Manufacturing,North Ridgeville, OH)之间，避免花粉从叶片表面飘散。在计数花粉颗粒数前，粘板和叶片被带回实验室并分别冷冻在-20℃和-5℃。
为了测定花粉密度，粘板涂有染色酸性品红，电脑中有5个1cm2的涂料区域，由AIMS Lab(Fremont, CA) grabit白介素1.10版软件和松下(Secaucus, NJ)安装在解剖显微镜wv-d5100系统数码相机构成。计算机图像由Scion Image（弗雷德里克，MD）beta;4.0.2软件分析，确定花粉浓度。取下叶片上的接触纸，用酸性品红涂抹，接着计数在五个随机选取的在叶片中脉和边缘的1cm2的区域中花粉颗粒数，所有残留在叶片上的花粉也记为五个1cm2的区域中的花粉颗粒数，加上接触纸的花粉颗粒数一起计数。
场外花粉沉积，Iowa, 1999。在七块玉米地上，叶片上花粉浓度和粘板上花粉浓度在垂直于四个边界沿着横断线设置的若干点进行了观测。试验田的选择要求避开其他玉米花粉的干扰。试验田大约为2.3公顷，周围植被为大豆或杂草。
为了测量环境的花粉水平，在显微镜载玻片上涂甘油果冻（10），将竹竿垂直插入土壤中，载玻片水平放置在竹竿上，保持距离地面1m。为了测量乳草属植物叶片上的花粉沉积，在植株中上部取带叶茎干，将它作为胸花。将茎的底部插入连接着40dram处方小药瓶的塑料引信管，加入水和Floralife(Floralife,Waterboro, SC)，这样可以增加叶片寿命。小药瓶绑在插在试验田的长1m的竹竿顶端，所以叶片距离地面1m。
在垂直试验田边界的方向上，距离边界分别0、1、2、4、8、20和100m处设置竹竿和载玻片。盆栽和胸花在试验中都有使用，比较胸花和整株乳草属植物对花粉的拦截是否相同。载玻片和胸花在盛花期的前一天晚上放置在试验田中，在试验田中保持4天，这样就得出了盛花期时花粉沉积状况。载玻片收集和放置在50毫升离心管中并密封，叶片从胸花上摘下，将每片叶片都放置在拉链袋中。载玻片和胸花都放置在冰箱中直到可以检查他们，通常放置时间不超过两个星期。使用解剖显微镜的目镜网格显示0.25cm2区域，计算叶片和载玻片上花粉浓度，进行五次随机花粉浓度计数。这些相同的叶片和载玻片收集方式和花粉浓度测量程序都在以下Iowa研究中详细说明。
场内花粉沉积，Iowa, 2000a。由于降雨可能从植物的叶子去除花粉，在雨季的花粉沉积研究可能不表明花粉密度最大。为了估计沉积在植物叶片上花粉的最大值，累积计算在整个无雨开花期的花粉沉积量。每两个胸花和一个载玻片放置在采样点，试验田内共四个采样点，在距离试验田边缘6m距离处。每个采样点的花粉样本每两天收集一次。载玻片每两天换一次，胸花每两天换为新摘的带叶植物茎（叶片可以保持新鲜4天），最后将所有单独样本过程结果相加。
Iowa, 2000b。在两块试验田中收集乳草属植物叶片；植株距离试验田边界超过100m，采集工作在开花期结束的7月18日进行。摘取生在不同试验田不同区域的乳草属植物枝条的上部和中部的叶片。
Iowa, 2000c。在开花期到来前的四到五周时间，从当地收集的根茎繁殖移植到12块玉米地中，距离试验田边界大约8m，每个试验田栽32棵。这些植株是为了验证在三个不同时期的花粉沉积。7月14日3个试验田中75%开花期出现，7月24日所有的4个试验田都出现开花期，3个试验田为100%开花期，1个试验田为75%开花期。8月3日再次检查4个试验田，其中有3个在盛花期后10天，另一个为100%开花期。为了分析，试验田的数据结合产生了三个分类：75%开花期，100%开花期和盛花期后（10天）。在每个采样时间时，都从12个试验田随机选3个试验田，选取不同的植株摘下上三分之一处的叶片。
Iowa, 2000d。在开花期前，盆栽植株要沿着横断方向放置在玉米地内。一簇六株距离试验田边界0、3、25m。5月14日（5%开花期）、5月18日（60%开花期）、5月21日（50%开花期）、5月24日（75%开花期）、5月30日（100%开花期）分别从上部、中间、下部三分之一摘叶片。
结果分析
实验室和试验田的饲养试验，确定了Bt玉米花粉对第一龄幼虫的典型影响（5,6）。在饲养幼虫时减少的叶片面积为0.25cm2，在四天的喂养周期中消耗1 cm2叶片。因此，我们使用的每一个样本的花粉密度是在一片叶子上而不是所有叶片的平均值，样本大小有0.25 cm2(Iowa studies)、 0.34 cm2(Maryland 2000)、1 cm2(Ontario 2000)。马里兰州1999(Maryland 1999)全叶平均值可以使用是因为花粉计数方法没有使用叶片采样。花粉浓度以平方厘米为单位表达，大多数花粉浓度研究中叶片是通过侧翼叶中脉至边缘测量的。在两项研究(Maryland 2000 and Iowa 2000d)沉积时，沿着中脉本身的沉积也进行了测量。只有互粉在叶片表面的沉积在大部分研究中出现。The Ontario 2000测量叶片底部的花粉，发现只有上表面的4%，因此忽视下表面的花粉会低估总体花粉浓度。
为了进行风险评估，我们希望知道在实验室和实际条件下幼虫遇到毒性阀值以上的花粉浓度的概率，因此研究观察到的花粉浓度频率分布和比例是比平均花粉浓度更有意义的。为了进行推广，我们综合所有的研究总结了一个单一频率分布，由于年轻的幼虫（1-3龄）不吃叶片中脉(K. Oberhauser, personal communication)，我们只用从侧翼叶中脉区得到的数据，中脉数据需要单独考虑。这是在所有研究基础上的平均概率分布。我们只选用研究中50-100%开花期的数据。每个研究的权重相同。场外的结果也以类似的方式结合来创建每个距离试验田边缘的距离的平均分布频率。
总结这些研究的困难的地方在于不同研究选取样本不同，在一些研究中研究员选择上部叶片(Maryland 2000, Iowa 2000c)；一些研究员选择了上部和中部的叶片(Iowa 2000b);有一些上部、中部、下部都选取(Maryland 1999, Ontario 2000, Iowa 2000d);还有一些研究中用胸花，这与植物中部叶片的大小和性质相似(Iowa 1999, 2000a)。叶片相对于玉米地的位置会影响叶片上的平均花粉浓度（见结果），除此之外，第一形态的幼虫没有被发现在上部、中部、底部的叶片上（见讨论）。幼虫对花粉浓度的影响与降水的影响相比很小，不应该将重点放在幼虫的影响上。我们简单地选择了已有样本，给每个样本相同的权重。
为了测试植物叶位置的影响，所有数据进行正态分析和方差齐性采用Spearman等级相关和Shapiro Wilk的W检验。如果数据不符合假设的单因素方差分析，需要在分组之前方差分析（11）。每平方厘米花粉浓度进行方差分析（12）。植物叶的位置进行固定效应，而每样被看作是一个随机的块效应。方法采用Tukey的学生化的范围测试分离。P值小于0.05被认为在
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