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运用消化法测量海水中磷酸盐的高性能微流控分析仪
(Francois-Eric Legireta,Vincent.J.Sieben,Eb. Malcolm S. Woodwardc,Samer K. Abi Kaed Beyb,Matthew C. Mowlemb,Douglas P. Connellyb,Eric P. Achterberga)
a National Oceanograpy Centre Southampton, Oceanamp;Earth Science, University of Southampton, European Southampton, 5014 3ZH, UK
b National Oceanography Centre Southampton, University of Southampton, European Southampton, 5014 3ZH, UK
c Plymouth Marine Laboratory, Prospect Place, The Hoe, Plymouth, PLl 3DH, UK
摘要：我们在对海水的可溶性磷酸盐测定的基础上报道了一种高性能的自动分析系统。此系统由一个（甲基丙烯酸甲酯）微流体芯片，一个自制的注射器泵，嵌入式控制电子板和板上校准标准仪组成。该“芯片实验”分析系统已经成功部署使用并与布置在英格兰西南部的沿海与热带北大西洋的分析系统的结果相互参考。此缩小版的分析系统测定结果与参考台操作的磷酸盐自动分析仪的测定结果的对比没有显著的差异（t检验在95%置信水平）。所使用的光学技术包含着色的有机玻璃和抛光的流体通道，基于该种方法目前可用的便携式系统之上允许两个数量级检测（52nm）对比。该系统具有宽的线性动态范围0.1-60mu;M和良好的精度（13.6% 在0.4mu;M，n=4）。分析结果在0.7mu;M硅酸盐干扰下进行校正，配置的测定频率为每小时可对采样20个样本。这种便携式微分析系统具有低的试剂要求（每样340mu;L）和功率消耗（每样745焦耳），并允许精确的高分辨率测定海水中可溶性活性磷酸盐。
关键词：磷酸盐测定，营养分析，微流控分析仪，消化法，硅酸盐干扰，海水
1.引言：
磷是海洋环境中一种重要的营养元素，参与了一系列的生化过程[1,2]。磷酸盐是海洋浮游植物吸收磷的主要来源，磷对它们的生长和繁殖至关重要[3]。虽然贫瘠的磷酸盐水平限制海洋生态系统中初级生产力[4]，但是由于人为输入使磷酸盐浓度增加[5]而导致过多的浮游植物迅猛生长以及一些令人讨厌的开花植物的扰动，这些都会对水质有潜在的不利影响。浮游植物群体的扰动会增强磷酸盐负荷[6]。因此，在自然水域中磷浓度限值被国际标准化组织减小[7]。这一国际水质政策的演变增加了运用灵敏的自动分析系统精确地测定磷酸盐浓度的需求。
各种分析技术已被应用于测量海水中可溶性活性磷（SRP），包括离子色谱法[ 8,9 ]和电化学[ 10 ]。然而，流动分析技术[ 11 ]因其选择性、灵敏性和准确性仍然是海水分析[ 12 ]的第一选择。钼蓝法是最常用的分析方法，它包括磷酸盐和钼酸盐体试剂之间的反应以及应用抗坏血酸使试剂逐渐变色到蓝色的复杂过程 [13 ]。选择比色技术也是基于钼多酸形成可用于含有磷钼钒的磷酸盐浓度的测量[ 14]，具体过程在文献中有描述。
磷酸盐的原位分析需要获取高精度的时空分辨率数据[17]。这种方法消除了水体样本在取样、样品处理和存储过程中的潜在改变，而这些步骤都是构成标准分析方法的主要污染来源[ 18 ]。在过去，一系列基于湿法化学原理的自主分析系统已被开发并用于天然水体中磷酸盐的测定[ 19-24 ]。在原位化学系统发展过程中主要面临的挑战包括减少其物理尺寸，大型仪器难以部署，并且这些大型仪器往往价钱啊是昂贵的，同时化学系统不能应用于较小的海洋平台（如浮标、遥控车、CTD花式框架）。此外，系统还会受到时间长度、仪器自由移动不可控、试剂以及电力供应限制影响试剂稳定性等因素的影响。
为了解决这些限制，我们采用小型灵敏并准确的“芯片实验室”技术化学方法[25-27]。此方法解决了许多在现场部署并保留自然水域的化学分析高性能的技术限制。这项研究描述了在海洋水域自动化监测磷酸盐浓度具有低功耗和低试剂消耗优势的微流控分析仪。微流控分析仪采用稳定消化试剂吧，现场测试并与位于沿海和公海海域的台式分析系统结果相比。稳定的试剂组合、低试剂和功率消耗的结合使得此微量分析仪经济、可行的用于各种海洋和淡水部署平台对磷酸盐浓度的监测。
- 材料与方法
2.1 实验方法
文章中磷酸盐浓度的测定原理为正磷酸盐与酸化的消化试剂快速直接反应生成黄色的络合物[28-31]。这种黄色试剂随着时间的推移一直保持着稳定混合试剂的状态，一年之后与四到六周的经典蓝色试剂比较[32]。海水中无机磷的种类包括磷酸，磷酸二氢，磷酸一氢，它们的平衡点取决于取决于所处环境的pH值。在酸性条件下，磷酸与钼酸铵离子显色反应生成磷钼酸：H3PO4 12MoO3→H3PMo12O40
在钼酸铵离子存在的条件下，这种合成体将形成复杂的磷钼钒酸,H4PVMoO40,该物质在385nm波长下摩尔吸光系数为3.6times;103mol-1cm-1。
在这项研究中使用的消化液用7.2克钼酸铵（A-7302，西格玛，多塞特，英格兰）和0.36克（20555-9偏钒酸铵，奥德里奇，多塞特，英格兰）溶解在95毫升浓缩液氯酸（西格玛奥德里奇，ACS试剂37%）配置和加高纯度的水（超纯，微孔，gt;18.2Omega;cm-1）到1L。用3mM的磷酸盐（0.40827 g L -磷酸二氢钾，西格玛奥德里奇）和从北大西洋表层水域收集并在实验室至少保存一年低营养的海水（LNSW）制做标准工作曲线，标准硅酸盐溶液1毫米（0.188 G L的氟硅酸钠，西格玛奥德里奇）是用来硅酸盐对磷酸盐测量干扰的研究。硅酸盐干扰所产生的误差的范围从1mu;M到100mu;M，符合在自然水域中发现的误差水平（World Ocean Atlas 2009，NOAA）。
2.2 微流体分析仪描述
黄色合成体的吸光度测量为磷酸盐提供了一种简单的测量方式。高功率紫外发光二极管（xrl-375-5e，375 nm，19-26兆瓦，roithner）作为光源，光电二极管（tsl257-lf，德克萨斯先进的光电解决方案公司）用作吸光度检测[33]。高功率紫外发光二极管和光电二极管用光学胶黏在微流体装备上。许多其他微流体的装备运用短波材质或者对耦合光学元件的芯片进行复杂的处理。然而这些可能对灵敏度和检测限产生负面影响。
微流体装置是由5毫米厚的着色聚甲基丙烯酸甲酯微细铣削制成的。有色有机玻璃的使用降低了来自环境源到达检测器的光源和来自于发光二极管不能穿过分析物漫射光的量[35]。溶剂蒸气结合工序用于黏合芯片两边的微流体歧管和盖[36]。这种技术产生了光滑通道，并允许安放更长的光学电池。造成此微分析系统具有显著的学设置特征的原因是使用不同浓度的显示试剂。芯片的流体歧管有25mm长，含有两个吸光室：一个参考单元和一个测量单元（图一）。除了两个光学吸光室是300mu;m宽和300mu;m深，其余所有通道都是150mu;m宽和300mu;m深。流体的运送通过七微惰性阀门的使用来执行，七微惰性阀门可以进行将进样切换到空白或有500毫升的板载标准存储液体袋的位置上。电动机用来驱动两个200mu;l由两个霍尔传感器控制的流体输送注射器。对注射器泵来说，这些霍尔效应传感器和放置在泵的滑动板上的磁铁两者之间预先校准的距离就形成了一个线性位移传感器。微流体装置的固定体积为500pL，将所有流体连接器，光纤对准槽和气门支架的死区体积最小化，而且把注射器泵支架直接铣在微流体装置上。海水采用0.45mu;m孔径聚醚砜millex-hp体积为100mu;l过滤单元（slhp033rs，微孔）进行取样。
光电二极管和最终数据的输出结果储存在2GB闪存卡中。故障容错文件系统确保数据没有丢失或功率损耗事件。微分析仪是使用自定义设计的嵌入式电子封装（5厘米times;6.2厘米times;4厘米）(图1），整个系统（图1）被安置在一个外直径10厘米、高度22厘米不漏水的丙烯管（未显示）中。
2.3 分析过程
实验分析过程涉及四个主要步骤：(1)从环境中提取水样本（2）样品的注入，将样品与试剂混合液注入到混频器（3）颜色的形成（4）吸光度测量。样本、空白样本或标准溶液的吸光度要在添加试剂之前在光槽中测定。这一步是必要的以此来纠正任何隐蔽的吸光度。空白，标准或样品与试剂的混合是通过一个250毫米长的蛇纹混合器在芯片上实现的。试剂和样本以1:1的比例、按200mu;l min-1的流速通过芯片泵入。混合的流体停止流动让溶液显色，相关的吸光度将在第二个光槽中测定。为了有充足的时间让反应显色，反应时间控制在在180s`~300s之间；较短的反应时间有较快的分析但会降低结果的灵敏度。同样的分析过程和反应时间运用在空白样本、标准液和样品中。为了尽量减少任何潜在的污染或样品间携带，用额外的320mu;L样品冲洗样品间的通道。冲洗时间相当于四个停注周期，并观察如图2A和C的连锁反应（由于水泵运行产生的噪音）。
Fig.1. (A)微分析仪的照片，包括一个定制的注射器泵，阀门，微流体芯片和电子产品。该测量系统22厘米高，直径为10厘米。（B）微流体芯片示意图。（C）晶片前后接合（微研磨有色有机玻璃）的照片。
Fig.2.(a)参考和测量的磷酸盐输出电压信号对比图(b)正常染色试剂浓度与吸光度的对照图(c)标准磷酸盐溶液序列输出电压关系图(d)磷酸盐溶液与标准磷酸盐的校正曲线
- 结果与讨论
3.1 校准与测量限
由于光电二极管的输出电压是成正比的入射光的强度，因此电压下降，溶液吸光度增加。
在特定的光学设备下，通过改变溶液的浓度得到不同浓度样本的吸光度（图二）。在较高的吸收值（gt;0.5 AU），校准曲线的多项式的性质（图2b）是LED和三维燃料吸收不匹配的光谱结果[26]。一系列标准磷酸溶液测量和参考光室的输出电压值对比（图2c）。浓度为0.2-60mu;M之间的标准磷酸盐的校正曲线（图2d）。该系统提供了在样本n=4，浓度60mu;M和在0.4浓度下测量精度为13.6%的动态线性反应范围。定义为三次空白值标准差的检测限（LOD）是基于对16行英格兰西南部空白水样的测量。考虑到被测物的测量与分析的空白值有统计学差异因子k= 3 ，国际应用化学联合会将52nm士6.2nm（n=16，k=3）范围内的检测限作为标准值[37]。检测限的确定包括系统误差和包括电气扰动，背景光，流体稳定性：流体产生波动和气泡产生的各种外部噪声。
3.2可溶硅干扰研究
溶解硅对用钼黄法测定磷酸盐产生的干扰是周知的[38,39]。硅酸盐具有和磷酸盐相似的离子结构，使其成为磷酸盐离子与钼离子结合的有力竞争者；两个硅和磷原子共价键共同得到4个氧原子。当氧原子显负电时，形成四面体结构的钼离子显正电。类似钼杂多酸化合物形成会对分析信号造成影响，在表1中描述了硅酸盐对磷酸盐信号的影响。硅酸盐浓度对磷酸信号的干扰表征关系不同取决于磷酸盐浓度。可溶性磷酸盐的测定通过使用这些关系可以校正硅的干扰。在3.3.2中描述的离岸断层中的硅酸盐的浓度是低的并接近恒定：0.71plusmn;0.06mu;M。此微型分析仪通过平均值相当于0.007点的可溶性磷酸盐信号来校正硅酸盐的干扰。河流和河口环境中有高浓度的硅酸盐，在这些河流中可溶性磷酸盐的测定会受到硅酸盐的影响。加入处理流来掩盖硅的干扰让新系统设计有能力解决硅的干扰[38]。
3.3 海洋水域的实地评估
3.3.1 沿海水域
此种微流体分析仪在英国接近普利茅斯英格兰西南部的海岸进行测试实验并在作为西部
通道天文台计划一部分登报在RV普利茅斯问题上(www.westernchannelobservatory.org.uk)。2010年9月完成了从近海海域到L4（50°15.00rsquo;N，4°13.02rsquo;W）浮标的抽样调查。我们分析的15个抽样样本中样品浓度波动范围在0.1到0.5mu;M之间。测定的平均值与每年这个时期L4浮标的记录数据是相匹配的 (http://www.westernchannelobservatory.org.uk/l4_nutrients.php)。然而花开之后，强调用高空间分辨率探测深水环境下的横断面磷酸盐浓度变化。
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