通过RNA-Seq研究三氯生、双酚A和双酚芴诱导斑马鱼脂代谢紊乱的差异机制外文翻译资料

 2022-08-28 11:49:54

英语原文共 13 页，剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

通过RNA-Seq研究三氯生、双酚A和双酚芴诱导斑马鱼脂代谢紊乱的差异机制

摘要

内分泌干扰物(EDCs)暴露与肥胖、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)等脂代谢疾病的诱导密切相关。在此，我们比较了三种EDCs暴露(三氯生、双酚A和双酚芴)对斑马鱼(Danio rerio)脂质代谢的影响。通过RNA-seq和qRT-PCR对不同的脂质代谢障碍进行深入分析，评估脂质障碍与RNA甲基化的关系。组织病理学观察和各种生理生化指标均表明，三氯生和双酚A在急性和慢性暴露下均可诱导肝脏脂肪堆积。RNA-Seq分析显示，三氯生暴露破坏了药物代谢、蔗糖代谢、脂肪代谢和胆汁分泌等多个生理过程。脂质代谢相关基因的异常调节表明，暴露于三氯生和BPA的斑马鱼肝脏脂肪变性是由于脂肪酸合成酶升高、beta;氧化的摄取和抑制引起的。此外，促炎基因的失调和内质网应激表明，三氯生和双酚A暴露不仅诱导了NAFLD的发生，还促进了肝脏炎症的进展。但与对照组相比，双酚芴暴露组的幼鱼出现了表型畸形，但对脂质代谢没有显著影响。此外，EDCs暴露导致幼鱼整体m6A水平下降，m6A调控因子表达异常。其中，三氯生暴露组去甲基化酶FTO(脂肪量和肥胖相关蛋白)表达显著增加。这些发现有助于我们深入理解EDCs暴露导致肥胖和NAFLD的潜在分子机制。

关键词

三氯生 双酚A 脂代谢紊乱 转录组测序 m6ARNA甲基化

1导言

内分泌干扰化学物质(EDC)是一种外源性物质能干扰生物体中激素的生物合成、代谢和分泌的污染物[1]。许多流行病学研究证实了EDC与代谢紊乱、胰岛素抵抗、肥胖和非酒精性脂肪肝(NAFLD)等重要代谢性疾病之间的密切关系[2]。许多环境污染物被归类为EDC，其中三氯生(TCS)、双酚A(BPA)和双酚芴(BHPF)是工业产品中广泛应用的三种优先污染物[3]和日用品[4,5]此外，由于对生物体的不利影响，它们引起了许多研究人员的广泛关注。作为广谱杀菌剂之一，TCS广泛应用于医药和个人护理产品[6]。毒理学研究表明，TCS可显著影响水生生物的生长、发育和繁殖[7,8]TCS通过增强脂质beta;氧化基因的mRNA表达，损害斑马鱼[9]的脂质代谢稳态。同样，我们小组证实，长期TCS暴露可引起斑马鱼生长发育异常，如脊柱弯曲、脂质代谢和游泳行为障碍[10]。作为典型的EDC之一，BPA的大剂量暴露有利于代谢性疾病的上升，特别是肥胖和糖尿病[11]。由于BPA暴露的不利影响，一些化学品被引入市场作为其替代品。例如，BHPF是材料或容器中广泛使用的BPA替代品之一；然而，其长期暴露具有抗雌激素作用[12]和不良妊娠效应，可能是由于内分泌系统稳态的变化[13,14]。急性BHPF暴露会导致一系列不良反应，如破坏卵母细胞成熟，降低卵母细胞质量[14]，以及改变斑马鱼幼鱼的睡眠行为[15]。然而，到目前为止，关于BHPF对斑马鱼脂质代谢的影响的信息很少。

虽然一些研究已经为EDC暴露对脂质代谢的影响提供了证据[16,17]，相关分子机制尚不清楚。作内分泌干扰化学物质(EDC)是一种外源性物质能干扰生物体中激素的生物合成、代谢和分泌的污染物[16]。许多流行病学研究证实了EDC与代谢紊乱、胰岛素抵抗、肥胖和非酒精性脂肪肝(NAFLD)等重要代谢性疾病之间的密切关系[18]。为表观遗传标记，N6-甲基腺苷(m6A)是真核信使RNA(mRNA)中最普遍的修饰之一[19]。m6A在mRNA上转录后安装，擦除和识别甲基转移酶复合物。这些复合物包括甲基转移酶样3和14(METTL3和METTL14)，Wilms肿瘤1-缔合蛋白(WTAP)、去甲基化酶(FTO)和ALKBH5，以及各种m6A特异性结合蛋白YTHDF1-3和YTHDC1[20]。另外，m6ARNA甲基化影响多种生物学过程(细胞分化、体重指数(BMI)和代谢)，提示其在代谢疾病中的关键作用[21]。

斑马鱼是研究代谢障碍的极好模型,是因为其保守的功能，如食欲调节，胰岛素调节和脂质储存[22]。在本研究中，我们以斑马鱼为模型，分析TCS、BPA和BHPF暴露是否引起脂质代谢紊乱，并评估脂质紊乱与RNA甲基化的关系。这些发现促进了我们对EDC暴露导致肥胖和NAFLD的分子机制的深入理解，也帮助我们深入了解表观遗传学在毒理学机制研究中的作用。

2材料和方法

2.1斑马鱼饲养和化学暴露

本研究中使用的野生型AB线斑马鱼是在标准条件（28plusmn;1）℃下饲养的，14小时/10小时昼夜节律周期)，他们每天吃三次活盐水虾，遵循韦斯特菲尔德的方法[23]。所有实验程序均按照温州医科大学机构动物护理和使用委员会(IACUC)的指导方针进行。

将包括TCS、BPA和BHPF在内的三个EDC溶解在丙酮中作为储存液(2mg/mL)，保存在-20℃。基于我们的以前的工作涉及一系列浓度梯度暴露[12,24]我们根据其LC50的1/3选择适当的TCS浓度(200mu;g/L）和具有代表性的表型特征，以探索相关的分子机制。为了进一步比较TCS、BPA和BHPF的毒性效应之间的相似性和差异，三种EDC暴露水平均设定为200mu;g/L。对照组采用0.0025%丙酮处理。用系统水（循环系统纯化的脱氯自来水）将储存液稀释至适当浓度，并每天更新暴露液，以在整个实验期间保持稳定的暴露浓度。

—

急性暴露实验的胚胎在96孔板中饲养，每孔一个胚胎含有200uL溶液，从6至120hpf（受精后小时）。对于慢性暴露，在120hpf下孵化良好的幼鱼被转移到含有2.5L水的标准槽中，直到90dpf。每个处理包括3个缸，代表3个生物复制。总共使用了12个缸（每个缸中有15个斑马鱼），用于一个对照组和三个治疗组。每个测试项目中的详细采样大小和时间汇总在表S2中。

在EDC暴露后，我们随机采集12、24、36和48hpf的幼鱼进行形态学观察，并用光学显微镜[25]拍摄。用0.03%三卡因麻醉96hpf幼鱼和性成熟斑马鱼(缓冲MS-222，Sigma，St)。分别用于畸形率和基本生长信息的统计。

2.2油红O(ORO)染色，生物标志物检测及组织病理学观察

根据标准协议[26]采用ORO染色法观察急性和慢性EDC暴露后幼鱼和成年斑马鱼肝脏脂质积累情况。此外，用苏木精和伊红(Hamp;E)染色法观察了成年斑马鱼肝脏组织的形态学和结构改变[27]。用酶反应比色法[28]测定120hpf幼鱼和90dpf成鱼肝脏中甘油三酯(TG)和总胆固醇(T-CHO)的含量)。

2.3全载原位杂交(WISH)和Westernblot

用These报道的FTO和mettl3探针进行了WISH[29]，并由显微镜记录相机[30]。从斑马鱼幼鱼或肝脏组织中提取的总蛋白质提取物被重新溶解在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶中，并转移到聚偏氟乙烯膜[24,31]。

2.4RNA测序和生物信息学分析

首先，我们使用Trizol Regent(Invitrogen，CA，USA)制备总RNA。接下来，应用合格总RNA的aliquot（5mg）制备IlluminaRNA-seq文库，并按照供应商的推荐协议在IlluminaHiseq4000[32]上进行配对测序(300plusmn;50bp)。其次，利用Hisat软件，将测序数据与斑马鱼参考基因组[33]。第三，使用StringTie组装每个样本的读取，并通过StringTie和边缘R计算FPKM（每千份转录本每百万份映射读取），以评估所有mRNA的表达水平。最后，在log的基础上，通过R包筛选出具有差异表达水平的mRNA和基因2（折叠变化）gt;1或lt;1，并在plt;0.05水平。随后，利用基因本体(GO)对上述筛选的差异基因进行了功能和信号通路分析[34]和京都基因百科全书[35,36]。

2.5qRT-PCR和m6ARNA甲基化定量

用TRIzol Regent[37]提取匀浆斑马鱼的总RNA。如表S3所示，基因引物采用NCBI引物BLAST以beta;-actin为内源性参考，由Sangon生物技术合成。全球mRNAm6A是用EpiQuiktrade;测定m6ARNA甲基化定量试剂盒(#P-9005，Epigentek，Farmingdale，NY，USA)[38]。

2.6统计分析

每个EDC暴露处理和对照组由三个生物和技术复制体组成，详见表S2。采用方差分析(ANOVA)评价TCS、BPA和BHFP暴露对斑马鱼发育、生化和生物信息学指标的影响。采用Dunnett试验分析对照组与治疗组的差异。所有数据均记录为平均plusmn;标准差(SD)，显著水平分别在plt;0.05（*）、plt;0.01（*）或plt;0.001（*）处。

3结果

3.1三种EDC急性暴露对斑马鱼幼鱼发育和脂质代谢的影响

TCS、BPA和BHPF都含有至少两个酚基(图 1A)，其分子结构与合成激素相似，具有潜在的内分泌干扰作用[39,40]，因此可以通过渗入斑马鱼而引起发育毒性。因此，我们对畸形率和异常进行了表征EDC暴露后不同发育阶段的表型。对照组3dpf幼鱼畸形率小于5.2%，提示胚胎质量可满足以下EDC暴露实验(图 1B)。在三个治疗组中，BPA的毒性作用最大，占总畸形率的36.9%，明显高于TCS（27.4%）和BHPF（20.3%）(图1B)。大多数异常斑马鱼有两种或两种以上的畸形症状，如卵黄囊肿、黑色素缺乏等(图1的C和D)。尤其是TCS在卵黄囊，头部，心脏和脊柱等部位产生一系列畸形症状。在TCS和BPA暴露组中，卵黄囊肿和黑色素缺乏持续36至72hpf；值得注意的是，卵黄囊肿占所有畸形的23-34%。卵黄囊水肿是一种斑马鱼发育毒性筛选中敏感的病理表型，其研究是揭示早期胚胎营养过程以及毒物诱发扰动的良好模型[41]。相比之下，BHPF暴露组卵黄囊肿仅占所有畸形的13%，明显低于TCS或BPA治疗组(图1C和D)。此外，观察到严重的静脉窦出血，表明BHPF对心血管发育的显著影响。因此，可以得出结论，在200mg/L的暴露浓度下，三个EDC都对胚胎发育产生了显著的毒性作用。TCS表现出与BPA相似的表型畸形，但与BHPF表现出明显的差异。

为了进一步了解EDC暴露对幼鱼脂肪代谢

剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

资料编号：[405300]，资料为PDF文档或Word文档，PDF文档可免费转换为Word

原文和译文剩余内容已隐藏，您需要先支付 30元 才能查看原文和译文全部内容！立即支付

以上是毕业论文外文翻译，课题毕业论文、任务书、文献综述、开题报告、程序设计、图纸设计等资料可联系客服协助查找。

您可能感兴趣的文章