好氧颗粒污泥在液体介质中长期储存：存活但不可增殖状态外文翻译资料

 2022-09-19 11:10:51

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好氧颗粒污泥在液体介质中长期储存：存活但不可增殖状态

摘要：长期储存后成功的活性复苏，对好氧颗粒污泥在废水处理的的实际应用十分重要。在SBR反应器中将不同方式保存的污泥：4℃下在五种不同液体介质，去离子水（SW）、丙酮（SA），丙酮/异戊酯混合（SAA），生理盐水（SS）、甲醛（SF）中保存1年以上。约四分之一的好氧颗粒污泥在培养24 h后成功复苏。活性污泥比耗氧速率大小为：SI gt; SS gt; SA gt; SAA gt; SW gt; SF；相应的颗粒强度（10 min超声）大小为：SI gt; SA = SS gt; SAA gt; SW gt;gt; SF。在储存过程中细胞分泌环二鸟苷酸（c-di-GMP）和鸟苷四磷酸（ppGpp）以应对外力挑战。我们认为使污泥处于存活但不可增殖状态（VBNC）最有利于好氧颗粒污泥的活性复苏。

关键词：好氧颗粒污泥；保存；信号分子；高通量测序；活的非可培养状态

1引言

　　好氧颗粒是具有三维内部结构并且不含载体的微生物聚集体。相比于传统的活性污泥絮体，好氧颗粒污泥具有以下几种优点：在工业用水中有较高的沉降速度、较高的耐冲击负荷和毒性。在液体培养基中，由于以下因素的恶化会导致好氧颗粒的结构将改变：丝状生物的生长、厌氧水解反应、功能菌株的损失、改变胞外聚合物的成分。好氧颗粒污泥通常储存在液体介质中，值得注意的是用葡萄糖和醋酸储存颗粒会使其失去代谢活动。朱等在2003年在室温条件下7周时间重新激活了他们的活性。曾等发现储存在4摄氏度下8周后好氧颗粒污泥三分之一的部分变成黑色。实验首次证明苯酚好氧颗粒物能够完好的保存在冰点温度（20℃）不会损失其颗粒活性和结构完整性。王等人将再生的颗粒储存在低温下7个月。高等人在不同温度下（房间温度，4℃，25℃）研究再生好氧颗粒物稳定性。元等人将颗粒储存在室温下用葡萄糖喂养，7天恢复其颗粒活性。吕等将好氧颗粒污泥储存在20℃下40天，然后解冻再重新冻结。最近，一个新的关于好氧颗粒在干燥球中干燥研究被提出，但这项研究仍处于早期阶段。

Adav等人发表谈论说，在储藏过程中，颗粒稳定性的损失是由于其内部颗粒蛋白水解引起的。李等人提出好氧颗粒会在储藏期间进行呼吸。徐等建议如苯酚等有毒的底物在颗粒储存时可以抑制厌氧菌的活性。恶劣的环境条件下（温度，盐浓度，氧浓度，重金属）能够使细胞进入VBNC状态。在VBNC状态下生物停滞生长，在适当条件下生物活性可以恢复，或许，低温或有毒物质（如苯酚）不仅可以抑制颗粒核心厌氧菌的厌氧活动，也可以使VBNC细胞颗粒保持稳定。

本研究假设细胞的VNBC状态是实现好氧颗粒污泥扩展储存的最好状态，将好氧颗粒污泥在4℃下不同的液体介质（去离子水，丙酮溶液，盐水，丙酮/异戊酯溶液，甲醛溶液）中培养一年以上。准确的说，是在储存温度的条件下，在完全无营养物质（去离子水），少营养物质 存在毒性（丙酮溶液或丙酮/异戊酯溶液），以及少营养物质 强渗透压（盐水）的条件下进行实验。在存贮颗粒被重新激活后测试它们的微生物群落，生物活性及结构稳定性。环二鸟苷酸（c-di-GMP）分子被用于反映细菌调节纤维素的合成（Wan et al., 2013a,b）。信号因子鸟苷四磷酸被用来表明在严格环境下对RNA合成的抑制作用（Braekenet al., 2006），同时本研究也测量存储的样本的细胞内c-di-GMP和ppGpp的含量并以此来作为颗粒进入VBNC状态的指标。

2培养方法

2.1颗粒污泥的培养

好氧颗粒污泥培养于一圆柱形SBR反应器（6 cm180cm）中，其工作容积为2.3 L 。1.6 L的合成废水泵入反应器启动SBR周期。废水的组成如下（g/L）：NH4Cl0.2, KH2PO4 0.66, K2HPO4 1.22, CaCl2 0.03, MgSO4·7H2O 0.025,FeSO4·5H2O 0.02, NaHCO30.013，蛋白胨0.4，酵母膏0.25，pH值7.2plusmn;0.1，COD在醋酸钠：丙酸钠= 3：1.的絮状污泥。MLSS约为6000mg/L。曝气量为5L/min。

好氧颗粒在30 d形成并逐渐成熟。随后，好氧颗粒被转移到另一个SBR圆柱形反应器（16 cm70cm），在4小时内循环使用好氧缺氧操作并加入醋酸钠以脱氮。以缺氧相作为碳源进行反硝化作用。4小时的周期为：10分钟的填充，290分钟的曝气，45分钟的缺氧混合与内部回流，5分钟的沉降，8分钟的滗析，空转2分钟。合成的城市污水处理反应器的组成为（g/L）：NH4Cl0.2, KH2PO40.026, CaCl20.01, MgSO47H2O 0.05, NaHCO30.5, peptone 0.02, pH 7.2 plusmn; 0.1,乙酸：丙酸= 3:1。50 d后得到了氮去除性能较好的活性污泥，筛选出的好氧颗粒污泥，进行30d的沉淀处理，不受干扰的颗粒物被丢弃。重复五次上述操作，收集其余的颗粒（硅颗粒），并保存。

图2.1 污泥形态图

2.2颗粒储存和再活化

好氧颗粒存储在4℃液体介质中，2012.10.20–2013.11.01。存储方式如下：

去离子水（SW）：好氧颗粒被放置在一个1升的肖特试剂瓶中，装500毫升去离子水，在4℃下保存。

丙酮（水杨酸）：好氧颗粒连续地被浸入50%，70%，90%，和100%的丙酮溶液。每组浸2 h后，将颗粒转移到一个1L的肖特试剂瓶（100%）中，用500毫升丙酮浸没，在4℃下储存。

生理盐水（SS）：好氧颗粒污泥储存在1L的肖特试剂瓶中，用3%NaCl溶液500 ml于4℃下保存

丙酮/异戊酯溶液（SAA）：好氧颗粒污泥依次浸没在50%，70%，90%，和100%丙酮溶液。每组浸没2小时。将颗粒转移到一个1L肖特试剂瓶中，装入500 mL丙酮溶液，加醋酸异戊酯在4℃下存储。

甲醛溶液：将好氧颗粒转移到一个1L肖特试剂瓶装入500毫升甲醛溶液。

3结果与讨论

3.1 颗粒污泥的物理性质

在贮存1年后，通过肉眼观察没有发现的SA, SS, SF颗粒的结构有明显的变化，但是SW颗粒有轻微的缩减，SAA颗粒严重收缩，（从4.3 plusmn; 0.5mm缩减到2.2 plusmn; 0.5 mm）（表1），颗粒体积的严重收缩可能是由于乙酸异戊酯的混合应用而造成的(Wu et al., 2010)。SEM的显微图像显示出SI和SW颗粒的细胞群都具有光滑的表面，但是另外4个颗粒的细胞群表面都是粗糙的。有毒的基板或高的渗透压施加的压力可能会导致细胞群结块。在超声波的作用下，SI颗粒会在20分钟内被击散。在10分钟时，A600标准下悬浮液浊度大小顺序为SW gt;SAA gt; SS = SA gt; SI；在30分钟时，大小顺序变为SS gt; SW= SA gt;SAA = SI（表S1）。SF颗粒由于稳定性太低而不能被测量到。虽然活性颗粒的结构性相比于原颗粒较弱，但它不会随着环境的恶化而衰减。

图3.1 活性污泥比耗氧速率

3.2颗粒的生物特性

活性颗粒的活性污泥比耗氧速率顺序为SI gt; SS gt; SA gt;SAA gt; SWgt; SF (表2)。

图3.2 好氧颗粒污泥形态图

SW颗粒的活性污泥比耗氧速率为28.0 mgO2g-1 MLSS h-1。SS颗粒的活性污泥比耗氧速率为26.0 mgO2g-1 MLSS h-1，大约占了活性SI颗粒的92%。SA、SAA和SW的活性污泥比耗氧速率分别为22.3、16.6和13.5 mgO2g-1 MLSS h-1，分别占活性SI颗粒的88%，58%和47%。SF的活性污泥比耗氧速率几乎可以忽略不计（2.54 mgO2g-1 MLSS h-1）。这些颗粒比那些没有在醋酸或葡萄糖溶液中储存过的颗粒拥有更高的活性(Tay et al., 2002)。饥饿培养相比于富营养的培养更为适宜，并且在高浓度氯化钠的饥饿培养下是有助于保持颗粒的活性的。

SI颗粒中的活细胞数大约占所有细胞的92.1%。而SW,SA,SS,SAA和SF颗粒的则分别占总细胞数的62.2%，75.3%，83.3%，68.0%和62.7%，除了SF颗粒由于拥有很低的活性污泥比耗氧速率（2.54 mgO2g-1 MLSS h-1）外其余的颗粒的细胞分数均与活性污泥比耗氧速率相关。这种现象的产生可能是由于甲醛具有穿透生物膜的能力并且在生物膜无损伤的情况下减少细胞内蛋白或核酸而导致的Ballantyne and Jordan,2001).。氯化钠溶液在用于颗粒保存活性污泥比耗氧和细胞生物膜损伤方面的研究优于其它的液体介质。

3.3微生物群落

在进行过滤式地粗略读取后，在34590，35831，35144，27941，和28263的分别可有效读取SI，SW，SA，SS，和SAA的颗粒。其平均长度分别为249.7，267.3，247.3，261.2，和267（SF颗粒大部分细胞死了，因此不在此处进行分析。）这五种颗粒样品的多样性指数如图4A所示。值得注意的是，存储在这些介质颗粒的微生物群落多样性（除SF）在1年的存储后仍保存完好。

图3.3 污泥死亡比

使用RDP爆破过滤后（3%截止），可获得140种如图4B所示。与Si颗粒相比，细菌群落激活颗粒发生显著变化。主成分分析结果表明，硅和水杨酸颗粒具有中等的相似性。集聚在一组中的SW和SS颗粒具有很高的相似性。SAA颗粒接近SW SS组微生物群落。SA和SAA的颗粒性质与SI颗粒沿P3轴呈反向发展。SW则表现出较高的相似性并且与SS沿P1和P2呈同向发展。

这主要研究（3%截止）超过了90%的颗粒，其中囊括了变形菌、黄杆菌，放线菌，beta;-菌，gamma;菌，鞘氨醇杆菌，和梭状芽胞杆菌（图4d）。变形菌纲，beta;-菌，gamma;菌类都属于变形菌门，广泛分布在颗粒的生物检测（Zhu et al.，2008）。而beta;-类涵盖了几乎所有在好氧颗粒污泥中的氨氧化细菌（Figueroa et al.，2008）。beta;-菌类约占50%的SI颗粒，并在其他的激活颗粒中beta;-类菌种的数量明显减少。黄杆菌和鞘氨醇杆菌类属于拟杆菌门，其丰度的变化在贮藏前后可以忽略不计。郭及其他人等（2011）还指出，黄杆菌类随着好氧颗粒污泥的产生而积累并逐渐成为优势菌种。这些菌株可能是能够在不利的环境下产出过量的EPS进行自我修复的颗粒。放线菌类是一种带有分生孢子和菌丝体的丝状革兰氏阳性菌，这是重要的初始聚集（刘，2006）。这项研究观察了2–5%梭状芽胞杆菌类厚壁菌门原颗粒存在最初的核心。发现了其他长期存储颗粒，因为它可以在极端环境下产生存活的梭状芽胞杆菌类的孢子。通过alpha;-变形菌纲，黄杆菌，放线菌，beta;-，gamma;，鞘氨醇杆菌和梭状芽胞杆菌的合作，它们作为一个团体互相帮助。

图3.5 鸟苷四磷酸浓度比

3.4 PPGPP与c-di-GMP浓度关系的研究结论

Si颗粒的c-di-GMP和ppGpp的胞内浓度低（分别为3.96和1.86 ug/g-1 MLSS）（图3.4）。SW、SA、SS和SAA颗粒胞内的c-di-GMP和ppGpp浓度分别为（10.1、13.2）、（13.2、21.5）、（15、18.1）和（12.6、19.9） ug/g-1 MLSS。总的来说，在再生颗粒之中，其胞内的c-di-GMP和 ppGpp的浓度呈现出明显的增加。

3.5 颗粒存储机制

对好氧颗粒污泥的储存效果是由土著需氧菌活性及在储存和再激活的三维矩阵的完整性确定。因此，本研究在4℃下长期采用离子水、丙酮、丙酮/异戊酯、3%的NaCl溶液和甲醛溶液混合的饥饿储存方式，此时间要超过1年。在激活之后，除甲醛外，所有存储的颗粒有足够有效的生物活性和稳定的三维结构。

存储在高压环境（长期的饥饿、毒性、渗透压）下的细胞通常表现出分泌更多的c-di-GMP和ppGpp（图5）。细胞内c-di-GMP可以调节细菌群集运动（jenal和马隆，2006）。虽然c-di-GMPfi所扮演的角色并未证实与颗粒稳定性有关，Wan及其他人等（2013C）指出，高含量的

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