磷酸三(2- 氯乙基)酯(TCEP)通过激活 hepg2细胞中的人癌途径基因诱发肝毒性外文翻译资料

 2023-03-25 21:07:18

磷酸三(2- 氯乙基)酯(TCEP)通过激活 hepg2细胞中的人癌途径基因诱发肝毒性

磷酸三(2- 氯乙基)酯(TCEP)是一种有机磷化学阻燃剂，广泛应用于日用消费品中，并在人体体液中检测到。肝细胞转录因子改变和毒性后果的研究仍然缺乏。在这里，人肝细胞(hepg2)细胞被100,200和400m TCEP 处理3天，用 mtt，nru 和 comet 测定肝毒性。流式细胞仪检测细胞凋亡、线粒体膜电位(dym)、氧化应激和钙离子内流。一个 qpcrarray 用于转录组分析。Mtt和nru数据显示400m时细胞存活率分别降低70.92% 和75.57% 。400m细胞周期数据显示，400m细胞出现65.96%的亚g1凋亡峰。在TCEP处理的细胞中记录到高水平的氧化应激、酯酶、ca2 内流和dym功能障碍。在84个基因中，qpcr 阵列显示17个基因表达上调，10个关键基因表达下调。我们的研究证实，在较高浓度和长时间暴露时，TCEP具有肝毒性潜能。

关键词: 磷酸三(2-氯乙基)酯; TCEP;转录组;有机磷化学阻燃剂; 细胞凋亡; hepg2

  1. 介绍

磷酸二乙酯(TCEP)是一种有机磷化学阻燃剂，广泛用于制造清漆、塑料、地板抛光剂、泡沫和家具等。TCEP在日用消费品中的广泛应用，证明其在环境、住宅区以及室内家居环境中的丰富性。 TCEP的报道主要集中在德国和中国的室内环境，如房屋、工作场所和学生宿舍[2,3]。智能手机中的阻燃剂证实了一种新的接触TCEP的来源，显示手机外壳中含有大量 TCEP(5.2102 ng/g)[4]。此外，从日本车厢里采集的灰尘样本，显示有71克TCEP。因此，人类可能因吸入或摄入受污染的车厢或空气中的尘埃而患上急性中毒[5]。

对暴露于含有 TCEP 的家用粉尘中的人进行的病例对照研究显示，发生临床意义重大的乳头状甲状腺癌的风险增加[6]。在2011-2015年期间，不受管制地使用 TCEP 已导致在人体中检测到其含量，范围为536至605纳克/脂质重量[7]。更重要的是，澳大利亚哺乳母亲的母乳中检测到了 TCEP (lt; 0.13ー0.47 ng/ml)。假设一岁以下婴儿每天摄入450毫升母乳，TCEP 的平均估计摄入量为每天4.6纳克/千克[8]。同样，在美国孕妇体内也发现了 TCEP 及其代谢产物[9]。对中国不同年龄组的323人进行的生物监测研究显示，尿液中存在 TCEP 及其代谢物，导致计算出的TCEP暴露限值为96.9ー46,700(相当于52.2ー25,200) ng/kg bw/d [10]。在医疗环境中，接受特定医疗仪器治疗的重症监护室患者也出现了尿液中的TCEP[11]。不仅人类面临着接触TCEP的风险，而且最近的一项环境研究还将TCEP列为中国和日本海湾中检测到最频繁的opfr。从中国饮用水厂抽取的不同等级(原水、制成水和自来水)的水样本，亦证实含有TCEP。因此，TCEP已经被认定为“致癌物”，并被列为致癌物质第二类，高毒性，在环境中持久。

关于动物毒性，体内研究显示，TCEP诱导癌症和睾丸损伤，导致大鼠生殖系统受损[13,14]。此外，SD大鼠暴露于TCEP(50-250毫克/千克体重)60天，随着神经系统改变，引发代谢改变，即空间学习、记忆功能下降，脑细胞凋亡和坏死病变增加。暴露大鼠皮质区还可观察到炎性细胞浸润和钙化/骨化灶形成[15]。

体外研究TCEP对肝细胞的毒性作用仍然难以捉摸。我们很少遇到过TCEP肝毒性的报道。例如，在体外条件下，人肝癌(hep3b)细胞通过 p21waf1/cip1-rb 途径暴露于TCEP，表现出细胞存活率降低和生长停滞等衰老现象[16]。同样，暴露于 TCEP 的大鼠肝细胞系在较高浓度(50-100m)下细胞存活率降低。此外，h4iie的酶活性在接触TCEP后增强[17]。人肝细胞(hepg2)细胞暴露于 TCEP 和苯并(a)比利牛斯混合物中，可通过活化 egfr-erk1/2通路释放炎症反应(il-6和 il-8)[18]。Rna 测序(rna-seq)的 hepg2细胞暴露于TCEP的亚致死浓度(亚致死浓度)红花基因的几个相关基因的药物代谢，免疫反应，和类固醇激素的生物合成[19]。此外，染毒于TCEP的hepg2细胞通过减弱sirt1非依赖的 pi3k/akt/mtor 通路表现出细胞毒性和生长停滞[20]。另一方面，对非肝细胞的体外研究也证实了 TCEP 对人淋巴细胞的毒性[21]。人肺泡基底上皮细胞暴露于TCEP(50-300m)48h后，显示出相当数量的细胞毒性，以及线粒体损伤，通过caspasepathway导致细胞凋亡。此外，神经元细胞中的o连接的n-乙酰氨基葡萄糖(o-glcnac)转移酶活性在接触100mTCEP[23]后显著下降到30%。

除了吸入途径，含有TCEP的灰尘也可能被摄入和代谢，导致器官中毒，包括肝脏异常[5,13,14]。然而，到目前为止，还没有一项研究能够揭示代谢基因和信号转导基因之间的相互作用，这些基因在TCEP诱导的肝毒性和诱导人类肝细胞的癌症通路中起着关键的作用。本研究对TCEP的这种观点进行了评估，为填补这一信息鸿沟提供了新的数据。我们用hepg2细胞，因为它们具有高度的分化能力，并且与正常肝细胞具有基因典型性。Hepg2的这些特性使其成为化学物质毒理学筛选的首选细胞系[24]。将 hepg2细胞暴露于100ー400 m TCEP 中3天，测定其毒性后果。用mtt法和nru法测定细胞毒性。Dna链断裂通过彗星实验进行了定量分析。流式细胞仪分析用于检测细胞死亡、氧化应激和线粒体膜电位。转录组学改变通过包含84个属于人类癌症通路网络的基因的qpcr阵列板进行分析。

  1. 材料和方法

2.1.采用细胞培养、TCEP浓度测定和nru检测方法

对纯度为97%的磷酸三氯乙酯(TCEP)的细胞毒性进行了定量研究。Hepg2细胞系来源于美国型培养基(美国贝茨维尔，md)。在不完全的rpmi-1640培养基中，加入低浓度(5,10,25,50 m)和高浓度(100,200,400 m)的 TCEP，在CO2培养箱中(湿度为5% ，95%)、温度为37℃处理 hepg2细胞，首先分析TCEP暴露浓度的选择和暴露时间。在接触两天后，在上述浓度没有发现细胞毒性作用(数据未显示)。只有较高浓度(100,200,400 m)的 TCEP 3天后显示出明显的细胞毒性。因此，这些浓度被选择用于进一步的实验。

2.2.TCEP 对 hepg2细胞的细胞毒性作用

用我们先前描述的方法定量。Mtt法中，将hepg2细胞种植在96孔板中，在湿度为95% 的CO2培养箱中在37℃培养一夜。第二天，细胞培养基在无菌条件下培养。将含有不同浓度(100,200,400 m)TCEP的新鲜不完全 rpmi-1640培养基分配到预定孔中，未处理的对照孔仅用新鲜不完全 rpmi-1640培养基补充。随后，细胞在CO2培养箱(5% ，95% 的湿度)中培养3天，完成3天后，将培养基丢弃，用ca2 和 mg2 -低磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞。然后，将细胞培养液中制备的5mg/ml的mtt染料分配到所有培养基中，在37℃培养基中培养4h，经规定的培养时间后，从每个培养基中吸出含染料的培养液并丢弃。然后将DMSO(200l)分配到所有的孔中，溶解不溶性甲醛晶体，在微型板式读片器上测定其吸光度为550nm (热力学，上海，中国)。

TCEP诱导的溶酶体脆性，作为细胞毒性的指标，用Nru检测来定量。Nru 法中，将 hepg2细胞种植在96孔板中，在CO2培养箱中(湿度为5% ，95%)37℃培养一夜。然后，从隔夜培养的 hepg2细胞的培养基中去除旧培养基，将含有 TCEP (100,200,400 m)的新鲜培养基(不完全 rpmi-1640)分配到预定的培养基中。在相似的条件下，只有不完整的 rpmi-1640介质被加入到未处理的控制孔中。在CO2培养箱中(湿度为5% ，95%) ，让 hepg2细胞在37℃培养箱中生长3天。3天后，去除细胞培养基，用无 ca2 和 mg2 的 PBS 清洗细胞。将在不完全 rpmi-1640培养基中新制备的中性红染料(50g/ml)加入所有培养基中，在37℃的CO2培养箱中(5% ，湿度95%)加入染料培养3h。然后丢弃染料，用含氯化钙(1%)和甲醛(0.5%)的溶液洗涤细胞。另外，hepg2细胞在1% 醋酸和50% 乙醇的37℃中培养20分钟以提取染料。最后，在一个微型板读取器上在550纳米处测量显示在孔中的红色吸光度[25]。

2.3.碱性彗星电泳(碱性彗星电泳)

诱导 hepg2细胞DNA损伤的定量方法与之前的碱性彗星电泳(碱性彗星电泳)[26]相同。首先，将 hepg2细胞种植在24孔平板中，在CO2培养箱中(湿度为5% ，95%)培养一夜后生长至37℃。第二天，细胞培养液从孔中倒出，新鲜的不完整的 rpmi-1640培养液分别含有100,200和400米的TCEP被分配到他们预先指定的孔中。未经处理的对照孔仅在 rpmi-1640培养基中补充。然后，在CO2培养箱中(湿度为5% ，95%) ，让 hepg2细胞在TCEP存在下在37℃培养箱中生长3天。阳性对照组将 hepg2细胞置于含有甲基磺酸乙酯(EMS)(2mm)的不完全 rpmi-1640培养基中，在CO2培养箱中培养2h (湿度为5% ，95%) ，然后按照后续步骤进行彗星载玻片制备。暴露3天后，用0.1% 的edta胰蛋白酶分离 hepg2细胞，1000转/分钟旋转获得细胞颗粒。旧的细胞培养基被吸出并扔掉。Ca2 -和 mg2 -PBS (每分钟1000转，3分钟)分别处理细胞2次。随后，每管加入100l PBS 悬浮细胞，再加入100L1% 的低度琼脂糖(lma)。为了制作单片彗星载玻片，将80l的细胞琼脂糖混合物从试管中吸出并覆盖在1/3磨砂端载玻片上，预先涂上1% 的普通磨砂琼脂糖(nma) ，然后迅速放置一个玻璃盖载玻片(2460mm，编号1)。采用上述工艺制备了不同浓度和不同控制条件下的复制载玻片，并将所有载玻片放在冰上，使琼脂糖凝胶化。然后，轻轻地去除遮盖物，在每个遮盖物上覆盖90 lma (0.5%) ，并留在冰上凝胶固化。将载片置于 nacl 2.5 m，edta 100mm，tris 10mm，triton x1001% ，ph 10的溶解液中，4℃，24h，降解细胞膜。所有载片均浸于电泳缓冲液中(300mm naoh，1mm edta，ph gt; 13)20min，24v 电泳30min。后电泳，中和缓冲液(tris-hcl 0.4 mm; ph7.5)加在载玻片上5 min (3次重复) ，DNA用溴化乙锭染色(20 g/ml)[26]。DNA损伤的定量是在50个细胞/载玻片/浓度中随机进行的，彗星成像是使用荧光显微镜(日本东京 eclipse 80i)和 cometassay iv 软件(英国埋葬圣埃德蒙兹的感知仪器)进行的。

2.4.流式细胞仪研究

2.4.1。细胞周期分析

细胞周期功能障碍是按照以前描述的方法[27]进行分析。简而言之，在CO2培养箱中(湿度为5% ，95%) ，将 hepg2细胞在37℃的24孔平板中隔夜接种。第二天，从孔中取出的细胞培养基被丢弃，然后在含有100,200和400米 TCEP 的 rpmi-1640培养基中补充。对照组只接受不完全的 rpmi-1640培养基。然后在CO2培养箱中(5% ，95% 的湿度) ，让细胞在 TCEP 存在下在37℃培养箱中生长3天。在规定的培养天数之后，细胞被分离，并且在1000转每分钟离心获得微丸。废弃培养基，用冷 PBS 洗涤两次。细胞颗粒悬浮在500l 的冷冻乙醇(70%)中，冰冻1小时后，细胞在1000rpm3分钟离心，然后丢弃乙醇。最后将微丸悬浮于染色剂500l 中(rnase a0.05 mg/ml，碘化丙啶50g/ml，triton x10000.1%)。细胞在室温下染色1h。在流式细胞仪上通过675个带通滤波器在 fl-3通道上读取共计10000个细胞。细胞周期变化分析 coulter epicsxl/xl-mcl，system ii 软件，版本3.0[27]。

2.4.2.

用前面描述的方法测量了暴露于 TCEP 的细胞中的 ca2 内流、线粒体膜电位(dym)、 ca2 内流和线粒体膜电位(dym)。在开始实验之前，将 hepg2细胞分别种植在24个孔板中，并在CO2培养箱中(5% ，95%

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