毒性基因组学方法筛选氯代阻燃剂三(2‐氯乙基)磷酸盐和三(2‐氯异丙基)磷酸盐的潜在健康影响外文翻译资料

 2023-03-25 21:07:25

毒性基因组学方法筛选氯代阻燃剂三(2‐氯乙基)磷酸盐和三(2‐氯异丙基)磷酸盐的潜在健康影响

Boris V Krivoshiev 1 , Gerrit T S Beemster 2 , Katrien Sprangers 2 , Ronny Blust 1 , Steven J Husson 1

Affiliations

1 Department of Biology, Systemic Physiological amp; Ecotoxicological Research, University of Antwerp, Antwerp, Belgium.

2 Department of Biology, Integrated Molecular Plant Physiology Research, University of Antwerp, Antwerp, Belgium.

摘要：三(2‐氯乙基)磷酸盐(TCEP)是一种广泛使用的阻燃剂，考虑到其对健康的影响，已被确定为一种令人担忧的化学物质，因此自那以后其使用一直受到严格管制。三(2‐氯异丙基)磷酸(TCIPP)，一种TCEP的类似物，被认为是它的替代品。然而，与TCEP相比，TCIPP的毒理学影响知之甚少。我们使用RNA测序作为无偏和敏感的工具来识别和比较在人肝癌细胞系HepG2中TCEP和TCIPP在转录组水平上的影响。我们发现，与其他阻燃剂相比，TCEP和TCIPP的细胞毒性很小。用亚细胞毒浓度的两种化合物处理后发现，这两种化合物产生了相似的效果;这两种化合物被发现影响参与免疫反应和类固醇激素生物合成的基因，同时也以类似的方式影响外生代谢途径。特别是对免疫反应的影响，这两种化合物被证明可以改变强效多效补体成分受体C5a的表达。此外，在对TCEP和TCIPP应答时，发现涉及补体级联的效应蛋白以及其他有效炎症调节因子的编码基因表达发生了改变，进一步强调了它们对免疫功能的潜在影响。综上所述，鉴于TCIPP引起的影响与TCEP相似，且在较低浓度下，需要进一步研究TCIPP对健康的潜在影响，以便对该化合物进行完整的风险评估。

关键词：阻燃剂； HepG2； 作用方式； RNA-seq； 毒物基因组学

三(2‐氯乙基)磷酸盐(TCEP)是一种广泛使用的阻燃剂，考虑到其对健康的影响，已被确定为一种令人担忧的化学物质，因此自那以后其使用一直受到严格管制。三(2‐氯异丙基)磷酸(TCIPP)，一种TCEP的类似物，被认为是它的替代品。然而，与TCEP相比，TCIPP的毒理学影响知之甚少。我们使用RNA测序作为无偏和敏感的工具来识别和比较在人肝癌细胞系HepG2中TCEP和TCIPP在转录组水平上的影响。我们发现，与其他阻燃剂相比，TCEP和TCIPP的细胞毒性很小。用亚细胞毒浓度的两种化合物处理后发现，这两种化合物产生了相似的效果;这两种化合物被发现影响参与免疫反应和类固醇激素生物合成的基因，同时也以类似的方式影响外生代谢途径。特别是对免疫反应的影响，这两种化合物被证明可以改变强效多效补体成分受体C5a的表达。此外，在对TCEP和TCIPP应答时，发现涉及补体级联的效应蛋白以及其他有效炎症调节因子的编码基因表达发生了改变，进一步强调了它们对免疫功能的潜在影响。综上所述，鉴于TCIPP引起的影响与TCEP相似，且在较低浓度下，需要进一步研究TCIPP对健康的潜在影响，以便对该化合物进行完整的风险评估。

1介绍：

为了满足严格的消防安全标准，阻燃剂(FRs)被添加到广泛的材料，包括织物，建筑材料和电子产品。这些化学物质通过从过程中去除热量、炭化或用氯或溴反应物淬灭火焰中的自由基来抑制燃烧。因此，溴化FRs是几十年来的首选化合物，但由于其持久性、生物积累和毒性而逐渐被淘汰。例如，六溴环十二烷在2015年被逐步淘汰，而其他遗留的FRs，如多溴二苯醚基溴FRs被列为持久性有机污染物，随后在数年前被逐步淘汰。因此焦点转移到有机磷酸酯FRs,有机磷FRs声称20% FR总需求10%的溴化FRs 2006年在欧洲,与2004年全球消费大约210 000吨。

在这些不同种类的FRs中，存在一些结构相似的氯代化合物。三(2‐氯乙基)磷酸盐(TCEP)和三(2‐氯异丙基)磷酸盐(TCIPP)这两种化合物都被用作添加剂FRs，它们在化学结构上差别很小。由于它们用作添加剂，在许多基质中发现了它们，在某些情况下是最丰富的FRs，包括:室内灰尘，空气，水，食物来源和生物群。因此，人类对这些FRs的接触可通过多种途径产生。因此，在人血清、尿液、牛奶和胎盘中发现TCEP和TCIPP就不足为奇了。因此，TCEP和TCIPP可能对人类健康构成重大风险。

目前，这些和类似化合物的测试仅限于在实验动物中监测经典终点。此类研究发现，TCEP对大鼠具有中度急性毒性，但不具有基因毒性。然而，它被发现通过降低睾丸重量和精子数量影响雄性生殖而影响小鼠的生育能力，同时在大鼠和小鼠中也显示出致癌潜力。因此，TCEP被欧盟列为第2类生殖毒性物质和第2类致癌物。鉴于此，TCEP进一步被确定为高度关注物质，因此在2010年被列入候选名单。欧盟内部的化合物生产已经停止，化合物的消费量从1992年的10500吨下降到2009年的1000吨。据认为，TCEP分类和使用的这种变化允许TCIPP取代它，自那时以来，TCIPP在欧盟的产量在2000年为3.6万吨。与TCEP相似，TCIPP对大鼠有中度急性毒性，但不属于生殖毒性或致癌物。然而，值得注意的是，就其对生殖的影响而言，它是一个介于不分类和分类为第3类生殖毒物之间的边界案例。研究还表明，TCIPP缺乏致癌性研究，也没有足够的机制毒理学信息来充分解读其研究更好的前身TCEP的数据。然而，在一些研究中，TCIPP确实显示出潜在的致裂性迹象，但所有研究的数据大多是矛盾的。

正如TCEP案例所强调的那样，这种使用动物模型来识别所关注的化学品的方法已被证明是有用的。然而，显然需要更有效的策略来更好地筛选化合物的潜在健康影响，这可能有助于风险评估。为了解决这些问题，一份关于21世纪毒理学测试的报告强调，需要从用于调控的耗时费力的体内模型，转向更多的体外高通量方法，能够廉价地筛选化合物，有效且不杀死动物。这种方法还能够优先考虑需要进一步在经典体内模型中测试的化学物质，同时也能够填补开展全面风险评估所需的知识空白，例如将机械毒理学数据纳入风险评估过程。为此，必须使用能够阐明毒理学模式的体外检测方法，然后利用这些方法预测特定化合物的不良健康影响。具体来说，高通量体外检测已经被用于筛选和识别药物的脱靶效应，以及筛选和优先考虑FRs的神经毒性。为了用TCEP和TCIPP的机械数据来补充我们目前的知识，我们做了一些努力。然而，这些研究大多局限于研究对内分泌干扰的影响，与TCIPP相比，TCEP得到了更好的研究，这是相当令人担忧的，因为TCIPP现在已经在欧盟范围内超过了TCEP的使用。

组学技术的出现和发展使我们能够以非假设的方式生成毒理学相关数据。例如，转录组分析已被用于确定可能的毒理学作用模式，该模式已被用于确定暴露、不利健康影响和治疗靶点的生物标志物。它还显示了其在生成假说和识别感兴趣的候选基因方面的价值，这些候选基因可能会被进一步研究以理解表型反应。鉴于肝脏是一个主要的靶器官TCEP和TCIPP,转录组已经显示出在阐明其潜在毒性恐鸟,我们采用RNA序列识别变化在转录组水平的人类肝癌细胞,在应对TCEP和TCIPP HepG2。这不仅有助于阐明TCEP和TCIPP在相关人体模型中的毒理学MOA，而且有助于我们更好地理解和填补知识空白，特别是对于TCIPP。

2材料和方法

2.1化学药品和试剂

除非另有说明，TCEP (CAS 115‐96‐8)、TCIPP (CAS 13674‐84‐5，混合异构体)和所有其他化学品和试剂均购自Sigma‐Aldrich (St. Louis, MO, USA)。TCEP和TCIPP由二甲基亚砜(DMSO，ge;99.9%)组成，- 20℃保存。图1显示了TCEP和TCIPP的化学结构。市场上销售的TCIPP反应混合物由四种异构体组成，这些异构体从来没有分离过，也从来没有这样生产过(欧盟，2008)。同分异构体，三(2‐氯异丙基)磷酸，占反应混合物的50-80% (w/w)，而其余的同分异构体，包括;二(2‐氯‐1‐甲基乙基)2‐氯丙基磷酸(15 - 40% w/w)，二(2‐氯丙基)2‐氯‐1‐甲基乙基磷酸(lt;15% w/w)和三(2‐氯丙基)磷酸(lt;1% w/w)。

2.2细胞毒性

HepG2细胞(ATCC HB‐8065)在添加Earlersquo;s盐(Gibco, Carlsbad, CA, USA)、1 mM丙酮酸钠、4 mM L‐谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、50 IU ml - 1青霉素、50 mg ml - 1链霉素和10%热‐460 KRIVOSHIEV ET AL.灭活胎牛血清的最低必需培养基中培养。细胞最多传代25次。按照制造商的说明，使用LookOutreg;支原体聚合酶链反应(PCR)检测试剂盒(Sigma - Aldrich)对细胞进行支原体污染的常规评估。通过resazurin细胞活力测定TCEP和TCIPP的细胞毒性使用了resazurin钠盐(Sigma‐Aldrich)，并设计了类似于实际治疗条件的检测设置。接种HepG2细胞，使其附着并适应72小时。包括极高浓度的细胞毒性效应，而不考虑人们可能在人体中发现的潜在生理水平。处理持续72小时，在0.1% DMSO组成的TCEP (0-1000 mu;M)和TCIPP (0-100 mu;M)浓度范围内进行。与TCEP相比，TCIPP的起始物质有限，使用的浓度较低。当处理浓度和对照处理之间没有统计学意义时，使用单因素方差分析和Dunnett的多重比较检验来判定非细胞毒性浓度。

2.3 处理

HepG2细胞接种在6孔板中，分离/再附着后培养72小时适应。分别用浓度为25或250 mu;M的TCEP或浓度为2.5或25 mu;M的TCIPP处理细胞(从现在开始分别指定为低剂量和高剂量TCEP或TCIPP)。浓度的选择是任意的，但必须满足条件，即所使用的浓度是无细胞毒性的。用于低剂量处理的浓度相当于高剂量处理的浓度的十分之一。阴性对照仅用0.1%的DMSO处理。与使用类似组学技术调查FRs影响的其他研究一样，治疗持续72小时。在每个条件下进行3个重复的处理，包括单独的细胞播种、细胞生长、处理和RNA提取。

2.4 RNA序列

为了保证RNA的高质量和高产量，我们采用了TRIzol 和RNeasy联合方法。简单地说，这涉及到裂解细胞和使用TRIzol相分离提取总RNA，按照制造商的说明。包含原油总RNA提取的水相当时受到清理使用RNeasy装备根据制造商的指示,导致纯总RNA,量化和合格(260/280和230/280比率大于2)使用地理NanoDrop ND 1000分光光度计。RNA通过QIAxcel System (Qiagen)检测RNA完整性进一步合格，并在文库制备前在- 80°C保存。使用TruSeq链mRNA样品制备试剂盒(Illumina, San Diego, CA, USA)，按照制造商的协议构建测序库。简单地说，4 mu;g总RNA通过poly‐T寡聚附着磁珠纯化含有poly‐A的mRNA。然后利用二价阳离子和高温将mRNA片段化。然后利用随机的六聚体引物将片段逆转录为第一链cDNA，然后合成第二链cDNA，生成钝端双链cDNA。将未转化的RNA用RNase H孵育去除。片段3 端然后腺苷化，以防止在接合器结扎时相互结扎。将成功连接到适配器上的片段通过PCR方法进行纯化和富集，利用与适配器退火的引物来创建最终的cDNA文库。然后使用Illumina HiSeq 1500平台(Illumina)对构建的测序库进行配对末端测序(2 times;

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